Pim-3對急性肝損傷肝細(xì)胞凋亡的抑制作用.pdf

1、目的: 運用流體力學(xué)基因轉(zhuǎn)染方法，將已克隆的Pim-3基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入大鼠的肝臟內(nèi)并用LPS/D-GalN誘導(dǎo)急性肝損傷，觀察轉(zhuǎn)染后Bcl-2、p53等基因的表達(dá)變化及對肝細(xì)胞生長的影響。探討Pim-3基因?qū)毙愿螕p傷肝細(xì)胞凋亡的抑制作用及其機(jī)制。 方法: 32只大鼠隨機(jī)分成四組(8只/組)。A組為正常對照組，B、C和D組分別以林格氏液、空載質(zhì)粒和Pim-3基因重組質(zhì)粒溶液預(yù)處理大鼠，1天后給予LPS/D-GalN腹腔內(nèi)注射誘導(dǎo)急性

2、肝損傷，8h后或瀕死期處死大鼠，采集肝組織標(biāo)本。利用熒光顯微鏡觀測綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)水平；TUNEL分析檢測細(xì)胞凋亡情況，并用底物顯色法檢測Caspase-3活性；肝組織基因表達(dá)通過RT-PCR和Western blot進(jìn)行檢測。 結(jié)果: 1.固定后的肝組織冰凍切片在熒光顯微鏡下觀察，C組和D組肝組織有大量GFP表達(dá)，而A組和B組則無GFP表達(dá)，表明質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入肝組織內(nèi)，并在肝組織內(nèi)出現(xiàn)高表達(dá)。 2.

3、肝組織TUNEL分析各組大鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)，分別為：A組3.1％±1.7％、B組83.1％±12.6％、C組79.9％±13.4％和D組10.2％±6.9％，所有受LPS/D-GalN攻擊的處理組大鼠肝組織的細(xì)胞凋亡指數(shù)均明顯高于正常對照組，且B組和C組凋亡指數(shù)顯著高于D組(P＜0.01)，B組和C組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，提示Pim-3基因的活體內(nèi)轉(zhuǎn)染可顯著減輕LPS/D-GalN誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。

4、3.肝組織Caspase-3活性測定顯示各組大鼠分別為：A組107.1±75.0pmol/min.mg、B組728.8±185.8 pmol/min.mg、C組643.5+242.9 pmol/min.mg和D組250.1±84.3 pmol/min.mg，所有LPS/D-GalN攻擊大鼠Caspase-3活性明顯高于正常對照組，B組和C組顯著高于D組(P＜0.01)，而B組和C組間差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，提示內(nèi)毒素攻擊誘

5、導(dǎo)了大鼠肝組織Caspase-3的活性，而Pim-3基因的轉(zhuǎn)染則抑制了其活性。 4.各組大鼠肝組織Pim-3 mRNA的相對表達(dá)水平分別為：A組0.29±0.12、B組0.10±0.03、C組0.16±0.11和D組0.63±0.18；Pim-3蛋白質(zhì)的相對表達(dá)水平分別為：A組1.12±0.56、B組0.61±0.48、C組0.37±0.29和D組2.52±0.62，D組mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平較A、B和C三組高(P＜0.05)

6、，A組表達(dá)水平較B、C組高(P＜0.05)，B組和C組間則差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，提示正常大鼠肝組織有Pim-3基因表達(dá)，LPS/D-GalN的應(yīng)用可顯著抑制其表達(dá)，外源基因的轉(zhuǎn)染則可引起Pim-3基因高表達(dá)。 5.各組大鼠肝組織Bcl-2 mRNA的相對表達(dá)水平分別為：A組0.26±0.06、B組0.32±0.11、C組0.28±0.09和D組0.86±0.14；Bcl-2蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平分別為：A組0.91±0.

7、22、B組0.85±0.19、C組0.84±0.23和D組1.93±0.76，D組mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平較A、B和C三組高(P＜0.01)，而A、B和C三組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，提示Pim-3基因的應(yīng)用促進(jìn)了Bcl-2的表達(dá)。 6.各組大鼠肝組織p53 mRNA的相對表達(dá)水平分別為：A組0.57±0.38、B組1.17±0.71、C組1.23±0.85和D組0.22±0.16，D組p53表達(dá)水平低于A組、B和