Pim-3基因?qū)Ρ┌l(fā)性肝衰竭的肝保護(hù)效應(yīng)研究.pdf

1、暴發(fā)性肝衰竭(FHF)是死亡率極高，以大量肝細(xì)胞凋亡、嚴(yán)重肝損害為特征的臨床疾病。絲/蘇氨酸激酶Pim-3基因具有顯著的肝細(xì)胞凋亡抑制和生長(zhǎng)促進(jìn)效應(yīng)，預(yù)期能在FHF的疾病治療中發(fā)揮積極作用。為此，本課題進(jìn)行了Pim-3基因轉(zhuǎn)染動(dòng)物活體肝組織的實(shí)驗(yàn)，目的是探討Pim-3基因?qū)HF的組織修復(fù)或肝保護(hù)效應(yīng)及其作用機(jī)制。課題研究采取了多步驟分階段的方式進(jìn)行。首先，采用RT-PCR的方法，從大鼠心肌組織中分離并克隆了Pim-3基因。通過(guò)基因重組

2、技術(shù)，完成了Pim-3基因質(zhì)粒載體的構(gòu)建，并利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)順利地實(shí)現(xiàn)了重組體質(zhì)粒pEGFP-N2/Pim-3在體外真核細(xì)胞的表達(dá)和活性測(cè)定；其次，采用常規(guī)和流體力學(xué)方法進(jìn)行GFP表達(dá)質(zhì)粒溶液的鼠尾靜脈注射，證明常規(guī)注射和流體力學(xué)注射是兩種不同的活體基因轉(zhuǎn)染方法，具有不同的器官靶向性和基因轉(zhuǎn)染效率。其中流體力學(xué)方法是一個(gè)高效的肝靶向性動(dòng)物活體基因轉(zhuǎn)染方法；再次，采用腹腔注射LPS/D-GalN的方法建立FHF大鼠模型。找到了制備動(dòng)物模型

3、最佳的藥物劑量，證明小劑量LPS可誘導(dǎo)D-GalN致敏大鼠產(chǎn)生顯著但非致死性的急性肝衰竭。其中，肝細(xì)胞凋亡是LPS/D-GalN誘導(dǎo)的肝衰竭主要的病理形態(tài)學(xué)特征；第四，通過(guò)構(gòu)建體pEGFP-N2/Pim-3質(zhì)粒的大鼠活體肝靶向性轉(zhuǎn)染，證實(shí)該質(zhì)粒能有效地在體內(nèi)肝細(xì)胞表達(dá)，并發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制效應(yīng)：最后，采用致死劑量LPS/D-GalN處理大鼠，結(jié)果提示外源性Pim-3基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)移極有效地降低了動(dòng)物的死亡率和血清轉(zhuǎn)氨酶水平、減輕了肝組

4、織出血壞死性病變和炎性浸潤(rùn)，并使大片肝細(xì)胞凋亡得到逆轉(zhuǎn)。同時(shí)，外源性Pim-3基因在體內(nèi)的高表達(dá)也顯著地降低了肝組織和血清內(nèi)炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β水平以及肝組織損傷基因iNOS和凋亡誘導(dǎo)基因p53的表達(dá)，但促進(jìn)了抗凋亡蛋白Bcl-2的分泌。這些結(jié)果提示，外源性Pim-3基因的活體轉(zhuǎn)染能有效地保護(hù)大鼠免于LPS/D-GalN誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝衰竭的發(fā)生。其保護(hù)作用的產(chǎn)生主要在于肝細(xì)胞凋亡的抑制和組織炎性反應(yīng)的改善。 第一部

5、分 Pim-3基因克隆和質(zhì)粒載體構(gòu)建及其在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和活性研究 目的:克隆Pim-3基因和構(gòu)建其GFP表達(dá)質(zhì)粒，并研究其在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞凋亡與生存能力的影響。 方法:采用RT-PCR的方法從Wistar大鼠心肌組織中提取并克隆Pim-3基因，通過(guò)酶切和連接反應(yīng)構(gòu)建GFP表達(dá)質(zhì)粒，隨后經(jīng)酶切證實(shí)和測(cè)序鑒定；肝癌SMMC7721細(xì)胞采用常規(guī)的方法進(jìn)行培養(yǎng)和傳代，原代肝細(xì)胞采用二步膠原酶灌注法進(jìn)行分離；以陽(yáng)離子

6、脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法進(jìn)行體外細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染；基因轉(zhuǎn)染效率借助熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)進(jìn)行判斷；細(xì)胞的凋亡和存活情況通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和MTT分析檢測(cè)。 結(jié)論:成功構(gòu)建Pim-3基因GFP表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N2/Pim-3；該構(gòu)建體能有效地在真核細(xì)胞包括肝癌細(xì)胞和原代培養(yǎng)肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并發(fā)揮抑制凋亡和促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。 第二部分綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)鼠尾靜脈注射后的器官靶向性研究 目的:研究不同方式的鼠尾靜脈注射對(duì)綠色熒

7、光蛋白(GFP)基因器官靶向性的影響。 方法:雄性昆明小鼠40只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、流體力學(xué)注射組和常規(guī)注射組。流體力學(xué)和常規(guī)注射組再分為轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組，每組各8只小鼠。注射結(jié)束后24h采集血清檢測(cè)轉(zhuǎn)氨酶，并采集肝、脾、心、腎、肺和腦組織進(jìn)行冰凍切片，部分肝組織采用4％多聚甲醛固定后切片。熒光顯微鏡下觀察。 結(jié)論:流體力學(xué)方法是肝靶向性的活體基因轉(zhuǎn)染方法：GFP可作為該方法進(jìn)行目的基因研究的一個(gè)可靠和方便的示蹤劑。

8、 第三部分內(nèi)毒素誘導(dǎo)D-半乳糖胺致敏大鼠急性肝損傷或肝衰竭實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯?目的:研究非致死劑量LPS/D-GalN的肝損傷效應(yīng)和細(xì)胞凋亡在急性肝損傷或肝衰竭中的作用。 方法:48只Wistar大鼠進(jìn)行隨機(jī)對(duì)照分組實(shí)驗(yàn)，分為6h、24h和48h取材3大組(各16只)，每個(gè)大組再分為處理組和對(duì)照組(各8只)。處理組大鼠以LPS50μg/kg+D-GalN 300mg/kg，用1ml無(wú)菌生理鹽水溶解后腹腔內(nèi)注射，對(duì)照組動(dòng)物

9、僅腹腔內(nèi)注射1ml生理鹽水。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，門靜脈采血查血生化包括ALT、AST和TBIL;肝組織切片分別行光鏡、透射電鏡檢查和TUNEL分析：基因表達(dá)通過(guò)RT-PCR的方法檢測(cè)；24h處理鼠肝組織勻漿后行Caspases活性檢測(cè)。 結(jié)論:小劑量LPS可誘導(dǎo)D-GaIN致敏大鼠產(chǎn)生顯著但非致死性的急性肝衰竭；肝細(xì)胞凋亡是LPS/D-GalN誘導(dǎo)的肝衰竭主要的病理形態(tài)學(xué)特征，其發(fā)生在早期可能與iNOS基因、而中期和晚期可能與p53基

10、因的高表達(dá)有關(guān)，且至少三條凋亡通路參與了這種病理過(guò)程。 第四部分 Pim-3質(zhì)粒構(gòu)建體在活體肝組織表達(dá)和活性的研究 目的:研究Pim-3質(zhì)粒構(gòu)建體pEGFP-N2/Pim-3在活體肝組織的表達(dá)和活性。 方法:動(dòng)物采用隨機(jī)分組對(duì)照實(shí)驗(yàn)，基因活體內(nèi)肝靶向性轉(zhuǎn)染通過(guò)質(zhì)粒溶液的大鼠尾靜脈流體力學(xué)注射法完成，肝細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)則采用腹腔內(nèi)注射LPS和D-GalN來(lái)實(shí)現(xiàn)。四組動(dòng)物(8只/組)分別為：A組為正常對(duì)照組，B、C和D

11、組分別以林格氏液、空載質(zhì)粒和重組質(zhì)粒溶液行尾靜脈流體力學(xué)注射，1d后，予LPS/D-GalN腹腔內(nèi)注射，24h后處死動(dòng)物；肝組織報(bào)告基因GFP的表達(dá)通過(guò)熒光顯微鏡、目的基因Pim-3的表達(dá)通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)；肝細(xì)胞凋亡采用TUNEL分析，并進(jìn)行Caspase-3活性檢測(cè)。 結(jié)論:已構(gòu)建的重組體質(zhì)粒pEGFP-N2/Pim-3能在大鼠活體肝組織內(nèi)有效表達(dá)，并發(fā)揮其對(duì)肝細(xì)胞凋亡的抑制效應(yīng)。 第五部分 Pim-3表達(dá)質(zhì)粒

12、活體肝轉(zhuǎn)移對(duì)LPS/D-GalN誘導(dǎo)暴發(fā)性肝衰竭大鼠的保護(hù)效應(yīng)及其機(jī)制 目的:探討Pim-3基因?qū)Ρ┌l(fā)性肝衰竭大鼠的肝保護(hù)作用及其機(jī)制。 方法:32只大鼠隨機(jī)分成四組(8只/組)。A組為正常對(duì)照組，B、C和D組分別以林格氏液、空載質(zhì)粒和重組質(zhì)粒溶液預(yù)處理大鼠，1d后，予LPS/D-GalN腹腔內(nèi)注射誘導(dǎo)FHF，8h后或?yàn)l死期處死大鼠，采集標(biāo)本。另設(shè)32只大鼠分組觀察24h內(nèi)的死亡情況；血清轉(zhuǎn)氨酶水平通過(guò)全自動(dòng)血生化分析儀