暴發(fā)性肝衰竭腸道樹突狀細胞數(shù)量、成熟度和趨化能力的變化.pdf

1、目的:
　　暴發(fā)性肝衰竭(Fulminant hepatic failure，F(xiàn)HF)由于營養(yǎng)不良和肝功能異常，常并發(fā)自發(fā)性細菌性腹膜炎（spontaneous bacterial peritonitis，SBP），合并SBP的FHF死亡率明顯增高。目前認為SBP與腸壁淤血水腫，腸腔內(nèi)細菌增殖和細菌易位(bacterial translocation，BT)引起腸道屏障紊亂有關(guān)，同時與機體抗感染免疫防御功能下降以及氧化應激炎性細胞

2、因子進一步削弱腸道屏障作用關(guān)系密切。腸道屏障由腸道機械屏障、微生物屏障、免疫屏障和化學屏障組成，腸道免疫屏障被認為是阻止細菌入侵的第一道防線。樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)作為腸道免疫屏障的前哨，在調(diào)節(jié)免疫應答以及監(jiān)視腸道免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)過程中扮演重要角色，因此通過檢測腸道DCs的數(shù)量、成熟度和趨化能力變化進一步探討FHF腸道免疫屏障變化，為解釋FHF并發(fā)SBP提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　一、試劑

3、r>　　LPS，D-GalN，CD11c抗體，CD74抗體，CD83抗體，CD86抗體，小鼠CD11c磁珠，CCR7抗體，CCR9抗體，CCL21抗體，CCL25抗體
　　二、動物
　　雄性BALB/C小鼠180只，6-8周齡，體重18-22克。
　　三、實驗方法
　?。ㄒ唬﹦游锬Ｐ椭苽?br>　　利用細菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和D-氨基半乳糖(D-galactosamine，D-

4、GalN)制備FHF模型。將所有BALB/C小鼠，隨機分成四組，其中生理鹽水組(NS)20只，LPS組40只，D-GalN組40只，模型組(FHF，LPS+D-GalN)80只。給小鼠腹腔同時注射LPS(10μg/kg)和D-GalN(800mg/kg)造模。然后將小鼠置于環(huán)境溫度25℃，濕度70％的環(huán)境中繼續(xù)飼養(yǎng)9h。
　?。ǘ嶒灧椒?br>　　1、提取小鼠腸道CD11 c+DCs并應用流式細胞術(shù)鑒定其表面標志
　　分

5、離提取小鼠腸道的淋巴細胞，經(jīng)小鼠CD11c磁珠分選得到CD11 c+DCs，應用流式細胞術(shù)檢測其表面CD74、CD83和CD86，鑒定其成熟程度。
　　2、提取小鼠脾臟CD11c+DCs并應用流式細胞術(shù)鑒定其表面標志
　　分離提取小鼠脾臟的淋巴細胞，經(jīng)小鼠CD11c磁珠分選得到CD11c+DCs，應用流式細胞術(shù)檢測其表面CD74、CD83和CD86，鑒定其成熟程度。
　　3、免疫組化方法檢測FHF小鼠腸組織上CCR7和

6、CCR9及配體CCL21和CCL25的表達情況。
　　4、Western Blot方法檢測FHF小鼠腸組織CCR7和CCR9及配體CCL21和CCL25的表達水平。
　　5、Real-time PCR方法檢測FHF小鼠腸組織CCR7和CCR9及配體CCL21和CCL25 mRNA的表達水平
　　四、數(shù)據(jù)處理
　　實驗數(shù)據(jù)采用Mean±SD表示，采用Prism Graph6.0軟件統(tǒng)計分析，多組間比較采用非配對t檢

7、驗（unpaired t-test），P＜0.05提示統(tǒng)計學差異顯著。
　　結(jié)果：
　　一、FHF小鼠腸道CD11c+DCs數(shù)量和成熟度的變化
　　FHF小鼠腸道和脾臟CD11c+DCs的數(shù)量減少，與NS組和LPS組相比，CD11c+DCs表面表達的CD74、CD83和CD86明顯減低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明FHF時小鼠腸道CD11c+DCs數(shù)量減少，成熟度減低。
　　二、FHF小鼠腸組織DCs趨

8、化能力的變化
　?。ㄒ唬┠c組織CCR7、CCR9及其配體CCL21、CCL25的免疫組化染色
　　經(jīng)免疫組化染色，CCR7在NS組和LPS組上皮細胞和固有層細胞呈棕褐色，在D-GalN組表達減弱呈黃色，F(xiàn)HF組CCR7表達明顯降低(P＜0.01)，呈淡黃色。CCL21在固有層細胞胞漿表達很強的棕褐色染色，在D-GalN組表達減弱，F(xiàn)HF組表達顯著低于NS組和LPS組(P＜0001)。CCR9主要分布在上皮和腸道固有層，在NS

9、組和LPS組表達很強的棕褐色，在D-GalN組棕褐色顏色減弱，表達低于NS組和LPS組，F(xiàn)HF組表達明顯降低(P＜0.001)，其配體CCL25主要分布在腸上皮，固有層亦有少量分布，表達趨勢與CCR9相一致，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。
　?。ǘ┠c組織CCR7、CCR9及其配體CCL21、CCL25的蛋白表達
　　CCR7及配體CCL21，CCR9及配體CCL25的蛋白在NS組均有明顯的特異性條帶，LPS組上述幾種

10、蛋白表達變化不大，D-GalN組四種蛋白的表達均低于NS組和LPS組，F(xiàn)HF組CCR7和配體CCL21及CCR9及配體CCL25蛋白表達量顯著降低（P＜0.05）。
　?。ㄈ┠c組織CCR7、CCR9及其配體CCL21、CCL25的mRNA表達
　　FHF腸組織CCR7、CCR9及其配體CCL21、CCL25的mRNA均明顯少于NS組(P＜0.05)，D-GalN組mRNA表達也降低，但變化不及FHF組明顯。CCR7、CCR