胰島素對樹突狀細胞成熟的影響和急性心肌梗死患者循環(huán)中樹突狀細胞變化的研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)及其引起的臨床后果，如冠心病，已經(jīng)成為當今社會威脅人類健康的頭號殺手。近年的研究發(fā)現(xiàn)在AS病變斑塊內(nèi)發(fā)現(xiàn)有大量免疫細胞的聚集，如巨噬細胞、T 淋巴細胞、肥大細胞和樹突狀細胞(Dendritic cell，DCs)等，多種內(nèi)源性抗原和外源性抗原引起的免疫反應可促進AS的形成，因此有學者甚至提出AS實質(zhì)上是一種自身免疫炎癥反應性疾病。DCs是功能最強的專職性抗原遞呈細胞(Antigen p

2、resentation cell，APC)，也是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能激活初始型T淋巴細胞的APC，是機體免疫反應的始動者，在特異性細胞免疫和體液免疫中均起著十分重要的作用。隨著DCs在血管組織中的發(fā)現(xiàn)，DCs在動脈粥樣硬化斑塊形成、發(fā)展中的作用受到廣泛關注。近年來研究多種公認的致AS危險因素(如氧化型低密度脂蛋白(ox—LDL)、熱休克蛋白(HSP)、尼古丁、高糖、糖基化終產(chǎn)物、微生物等)都可促使DCs免疫功能成熟；由于代謝綜合癥患者發(fā)生冠

3、心病等動脈粥樣硬化病變的機率明顯增高，胰島素抵抗(Insulin resistence，IR)及高胰島素血癥也被認為是AS的重要危險因素之一，而近年來炎癥免疫被認為在IR發(fā)生中起著重要作用，但其引起AS機制尚不清楚；本研究首先在體外以高濃度胰島素為干預因素，觀察對人單核細胞源性DCs成熟的影響，并探討其可能機制。此外，最近研究發(fā)現(xiàn)在不穩(wěn)定AS斑塊中DCs聚集明顯增多，且多集中在AS斑塊的肩部，提示DCs參與的炎癥免疫反應可能在AS的發(fā)生

4、和斑塊不穩(wěn)定性的形成及斑塊破裂的過程中起了重要作用，我們觀察了急性心肌梗死患者循環(huán)中DCs及其亞型變化，從而進一步探討DCs參與的炎癥免疫反應在AS發(fā)病機制中的作用。本研究從細胞水平和臨床流行病學等角度研究 DCs在AS免疫機制中的作用，全文由二個部分組成。 第一部分高濃度胰島素對樹突狀細胞分化成熟的影響及其機制研究 目的：胰島素抵抗(IR)及高胰島素血癥是動脈粥樣硬化(AS)發(fā)生的重要危險因素，但其引起AS機制尚不明確

5、。樹突狀細胞(Dendritic cell，DCs)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的專職性抗原提呈細胞(APC)，近年來研究發(fā)現(xiàn)DCs參與了AS的免疫炎癥反應的過程。本文探討胰島素對人單核源的樹突狀細胞(monoeytederived dendritic cells，MoDCs)分化成熟、免疫功能的影響及其作用機制。 方法：采用免疫磁珠法分離人外周血CD14<'+>單核細胞，在含重組人粒-單核細胞集落刺激因子(rhGM-CSF，100ng

6、/ml)和重組人白細胞介素-4 (rhIL-4，20ng/ml)的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)五天使其分化為MoDCs，然后加入1nM、10nM、100nM濃度的胰島素干預24小時，另用磷脂酰肌醇3激酶(P13K)抑制劑(LY294002)及絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)抑制劑(PD98059)干預1小時后再加入10nM、100nM濃度的胰島素干預24小時，以磷酸鹽緩沖液(PBS)作為陰性對照組，以脂多糖(LPS)作為陽性對照組，干預24h后采用流

7、式細胞術檢測DCs表型(CD83、CD86)；FITC標記的Dextran檢測DCs吞噬功能；ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白介素-12(IL-12)等細胞因子的濃度。 結果：與PBS對照，10nM、100nM濃度的胰島素明顯上調(diào)了MoDCs表面CD83及共刺激分子CD86的表達(P<0.05)，且10nM、100nM濃度的胰島素促進MoDCs分泌細胞因子TNF-α、I

8、FN-γ和IL-12，10nM的胰島素減弱了MoDCs的吞噬功能的作用；而1nM的胰島素則沒有這種作用；PD98059及LY294002干預后使10nM、100nM濃度胰島素上調(diào)CD83及CD86表達及促進TNF-α、IFN-γ和IL-12分泌的作用明顯減弱(P<0.05)。 結論：高濃度胰島素促進了樹突狀細胞分化及免疫功能的成熟，這種作用是通過MAPK及P13K兩條途經(jīng)起作用的；高濃度胰島素可能通過促進DC免疫功能成熟參與了A

9、S免疫炎癥反應的發(fā)生、發(fā)展。 第二部分急性心肌梗死患者循環(huán)中樹突狀細胞及其亞型變化的研究 目的：近年來研究發(fā)現(xiàn)樹突狀細胞(Dendritic cell，DCs)參與了動脈粥樣硬化(AS)的免疫炎癥反應的過程。人的外周循環(huán)中主要有兩類樹突狀細胞：髓樣樹突細胞(mDC)和漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)；多種自身免疫系統(tǒng)疾病都伴有循環(huán)DCs及其亞型的改變。近年來發(fā)現(xiàn)，DCs參與的炎癥免疫反應可能與動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的形成密切

10、相關，本研究對不穩(wěn)定斑塊引起的極端狀態(tài)一急性心肌梗死患者外周循環(huán)中DCs及其亞型改變進行了研究。 方法：在我院心內(nèi)科住院冠心病患者 31例，其中ST段抬高型急性心肌梗死17例(發(fā)病24小時內(nèi))，穩(wěn)定型心絞痛患者14例(診斷依據(jù)病史，心電圖，心肌酶學和冠脈造影)；以性別年齡相匹配的15例冠狀動脈造影正常者為對照。采用流式細胞儀三色分析方法測定三組人群中外周血中DCs數(shù)目及其亞型的絕對數(shù)和百分數(shù)，其中DCs以Lin1<'->HLA-

11、DR<'+>確定，mDC以Lin1<'->HLA-DR<'+>CD11c<'+>確定，pDC以Lin1<'->HLA-DR<'+>CD123<'+>確定：其中ST段抬高型心肌梗死患者在心肌梗死發(fā)作后7天進行隨訪。并用ELISA法檢測各組患者外周血IL-6、和TNF-α水平。 結果：在急性ST段抬高型心肌梗死組、穩(wěn)定型心絞痛及正常對照組中mDC占外周血單個核細胞的百分比分別為0.037±0.035％，0.223±0.016％，0.

12、229±0.015％，三組中mDC的絕對數(shù)分別為3.78±0.85/μl，14.5±1.34/μl，14.84±0.97/μl，pDC所占的比例為0.018±0.023％，0.039±0.005％，0.056±0.006％，絕對數(shù)分別為1.51±0.46/μl，2.25±0.36/μl，3.29±0.31/μl，其中ST段抬高型心肌梗死患者mDC與pDC占外周血單個核細胞的比值及其絕對值較正常對照組和穩(wěn)定型心絞痛患者組均明顯下降(P均<

13、0.01)，穩(wěn)定型心絞痛組與正常對照組間外周血中mDC所占比例的差異沒有統(tǒng)計學意義，而pDC在外周血中所占的比例明顯下降(P<0.05)。在急性心肌梗死組一周后復查，mDC及pDC所占的百分比分別為0.214±0.102％和0.053±0.033％，兩者絕對數(shù)分別為14.99±2.05/μl和3.67±0.87/μl，在心肌梗死急性期(<24h)比較明顯增加(P均<0.01)。在心肌梗死急性期患者血清中細胞因子FNF-α(61.4±10