高糖、高胰島素對(duì)樹突狀細(xì)胞成熟及清道夫受體表達(dá)的影響及其機(jī)制.pdf

1、第一部分高糖和高濃度胰島素對(duì)樹突狀細(xì)胞免疫成熟的影響
　　目的:糖尿病是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，但其引起AS機(jī)制尚不明確。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DCs)是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的專職性抗原提呈細(xì)胞(APC)，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)DCs參與了AS的免疫炎癥反應(yīng)的過(guò)程。本部分探討不同濃度葡萄糖和胰島素對(duì)人單核源的樹突狀細(xì)胞(monocytederived dendritic cells，MoDCs)分化成熟、

2、免疫功能的影響。
　　方法:采用免疫磁珠法分離人外周血CD14+單核細(xì)胞，在含重組人粒-單核細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-C SF，100ng/ml)和重組人白細(xì)胞介素-4(rhIL-4，50ng/ml)的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)五天使其分化為未成熟DCs，在細(xì)胞培養(yǎng)的第六天，一組細(xì)胞分別加入終濃度為5.5mol/L、15mol/L、30mmon/L葡萄糖和30mmol/L甘露醇;另一組細(xì)胞分別加入終濃度為1nmol/L、10nmol/L、

3、100nmol/L濃度的胰島素，干預(yù)24h后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DCs表型(CD83、CD86、HLA-DR); FITC標(biāo)記的Dextran檢測(cè)DCs吞噬功能;ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)、白介素-12(IL-12)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細(xì)胞因子的濃度。
　　結(jié)果:與正常濃度葡萄糖(5.5mol/L)組相比，高濃度葡萄糖(15mol/L、30mmon/L)干預(yù)呈濃度依賴

4、性上調(diào)DCs表面共刺激分子CD86和成熟度標(biāo)志HLA-DR、CD83的表達(dá)，且分泌細(xì)胞因子IL-6、IL-12和TNF-α水平明顯升高，也呈濃度依賴性，IL-10的水平則較正常濃度葡萄糖明顯下降;與正常葡萄糖組相比，高濃度葡萄糖明顯降低了DCs的吞噬功能。與濃度1nmol/L胰島素干預(yù)組相比，10nmol/L、100nmol/L濃度的胰島素干預(yù)呈濃度依賴性上調(diào)了CD86、CD83、HLA-DR表面分子的表達(dá)，細(xì)胞因子IL-6、IL-12

5、和TNF-α水平呈濃度依賴性升高，IL-10的水平則明顯下降;與1nmol/L胰島素組相比，100nmol/L胰島素明顯降低了DCs的吞噬功能。
　　結(jié)論:高糖和高濃度胰島素是胰島素抵抗的重要組分，高濃度葡萄糖和高濃度胰島素是DCs免疫成熟和功能活化的重要刺激因素，這可能是DCs參與糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化炎癥免疫反應(yīng)發(fā)生的重要機(jī)制之一。
　　第二部分高糖和高濃度胰島素對(duì)樹突狀細(xì)胞清道夫受體表達(dá)的影響
　　目的:清道夫受體S

6、R-A、CD36、LOX-1在DCs攝取抗原及免疫功能成熟過(guò)程中起了重要作用，本部分探討不同濃度葡萄糖和胰島素對(duì)DCs清道夫受體SR-A、CD36、LOX-1表達(dá)及DCs攝取氧化低密度脂蛋白(oxLDL)的影響，并進(jìn)一步觀察SR-A、CD36、LOX-1在DCs攝取oxLDL過(guò)程中的作用。
　　方法:采用密度梯度離心結(jié)合免疫磁珠法分離人外周血CDi4+單核細(xì)胞，經(jīng)含100ng/ml rhGM-CSF和50ng/ml rhIL-4的

7、RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)5天，使其分化為未成熟DCs。一組細(xì)胞分別加入終濃度為5.5mol/L、15mol/L、30mmon/L葡萄糖，另一組細(xì)胞分別加入終濃度為1nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L濃度的胰島素，干預(yù)24h后，收集細(xì)胞。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)和Western Blot方法檢測(cè)DCs清道夫受體SR-A、CD36、LOX-1的表達(dá)。同時(shí)，用不同濃度葡萄糖和胰

8、島素干預(yù)DCs24小時(shí)后，加入或不加入SR-A、CD36、LOX-1阻斷抗體，將DCs與Dil標(biāo)記的oxLDL共同孵育3小時(shí)，采用激光共聚集方法觀測(cè)DCs吞噬oxLDL情況，并用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行定量分析。
　　結(jié)果:與5.5mol/L葡萄糖組相比，在mRNA和蛋白水平，15mol/L、30mmon/L均可明顯上調(diào)DCs表面清道夫受體SR-A、CD36、LOX-1的表達(dá)(p＜0.05)，與5.5mmol/L葡萄糖干預(yù)組相比，30mmo

9、l/L葡萄糖明顯促進(jìn)DCs吞噬oxLDL的能力(p＜0.05），該作用可被SR-A、CD36抗體阻斷，但LOX-1沒有此種作用。另外，與濃度1nmol/L胰島素干預(yù)組相比，10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L濃度的胰島素顯著上調(diào)了SR-A、CD36、LOX-1的表達(dá)(p＜0.05)，并且呈濃度依賴性，100nmol/L胰島素較1nmol/L胰島素明顯促進(jìn)DCs吞噬oxLDL的能力(p＜0.05），同樣該作用可被SR-A

10、、CD36抗體阻斷，但LOX-1沒有此種作用。
　　結(jié)論:高糖和高濃度胰島素明顯上調(diào)DCs表面清道夫受體SR-A、CD36、LOX-1的表達(dá);并且高糖和高濃度胰島素促進(jìn)DCs攝取oxLDL，這一過(guò)程主要通過(guò)SR-A和CD36完成的。高糖和高濃度胰島素對(duì)DCs清道夫受體表達(dá)的影響可能是糖尿病促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要機(jī)制。
　　第三部分高糖和高濃度胰島素對(duì)樹突狀細(xì)胞清道夫受體表達(dá)影響的機(jī)制研究
　　目的:探討高糖

11、和高濃度胰島素對(duì)DCs表面清道夫受體SR-A、CD36、LOX-1表達(dá)影響的作用機(jī)制。
　　方法:采用密度梯度離心結(jié)合免疫磁珠法分離人外周血CD14+單核細(xì)胞，經(jīng)含100ng/ml rhGM-CSF和50ng/ml rhIL-4的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)5天，使其分化為未成熟DCs。為研究葡萄糖對(duì)DCs清道夫受體表達(dá)影響，將細(xì)胞分為下列五組①5.5mmol/L葡萄糖、②30mmol/L葡萄糖、③30mmol/L葡萄糖+SB20

12、3580(p38MAPK阻斷劑)、④30mmol/L葡萄糖+NAC(ROS阻斷劑)、⑤30mmol/L葡萄糖+BAY11-7082(NF-κB阻斷劑)，采用Real-time PCR法和Western-blot法分別檢測(cè)DCs清道夫受體SR-A、CD36和LOX-1的mRNA和蛋白的表達(dá);同時(shí)在前四組中，采用Western blot法檢測(cè)核蛋白中NF-κB p65的表達(dá)情況。為研究胰島素對(duì)DCs清道夫受體表達(dá)的影響，將細(xì)胞分為下列四組①

13、1noml/L胰島素、②100nmol/L胰島素、③100mmol/L胰島素+LY294002（PI3K抑制劑）④100mmol/L胰島素+PD98059(MAPK抑制劑)，采用Real-time PCR法和Western-blot法分別檢測(cè)DCs清道夫受體SR-A、CD36和LOX-1的mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:與5.5mmol/L葡萄糖組相比，30mmol/L葡萄糖明顯促進(jìn)DCs清道夫受體SR-A、CD36、LOX-1

14、mRNA和蛋白的表達(dá)，SB203580、NAC、BAY11-7082預(yù)處理可明顯抑制SR-A、CD36、LOX-1mRNA和蛋白的表達(dá);同時(shí)，30mmol/L葡萄糖干預(yù)較5.5mmol/L葡萄糖明顯促進(jìn)NF-κB p65的表達(dá)，SB203580、NAC可明顯抑制其表達(dá)。另外，與1noml/L胰島素組相比，100nmol/L胰島素明顯促進(jìn)DCs清道夫受體SR-A、CD36、LOX-1mRNA和蛋白的表達(dá)，PD98059可明顯抑制100nm