干擾βTC-3細(xì)胞上胰島素受體表達(dá)對(duì)胰島素一相分泌的影響.pdf

1、研究背景：
　　據(jù)世界衛(wèi)生組織有關(guān)資料研究表明，在二十世紀(jì)八十年代中期，糖尿病患者總量在3000萬(wàn)人左右，至九十年代中期十年間，增長(zhǎng)4倍，達(dá)到1.2億人，預(yù)計(jì)到2005年全球糖尿病患者總量將再翻一番，達(dá)到2.4億人，年平均增長(zhǎng)率10％左右。我國(guó)糖尿病患病率近10年內(nèi)增長(zhǎng)很快，1980年患病率約為6.09‰，1993年患病率達(dá)2.5％，較10年前增長(zhǎng)4倍。死亡率已上升至繼腫瘤、心血管疾病之后的第三位。糖尿病帶來(lái)的健康和經(jīng)濟(jì)問(wèn)題已成為

2、困擾國(guó)民的難題。
　　2型糖尿病的主要發(fā)病機(jī)制是胰島素分泌缺陷和胰島素抵抗。胰島素受體一直被作為研究胰島素抵抗、2型糖尿病的主要候選基因，但胰島素受體在胰島素抵抗中所扮演的角色仍不清楚。胰島素受體編碼基因突變可直接導(dǎo)致胰島素效應(yīng)的降低；胰島素受體基因及蛋白表達(dá)量下調(diào)或胰島素受體降解增加可導(dǎo)致胰島素分泌障礙。上世紀(jì)80年代證實(shí)胰島β細(xì)胞上有胰島素受體和四種胰島素受體底物蛋白（insulin receptor substrates,I

3、RS）-1,2,3,4及其下游的轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白表達(dá)，如PI3K,p70s6k等。胰島β細(xì)胞中的胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白可以被葡萄糖或直接被胰島素刺激所活化，提示胰島β細(xì)胞也是胰島素作用的靶細(xì)胞。因此有學(xué)者提出了“β細(xì)胞上胰島素抵抗學(xué)說(shuō)”。β細(xì)胞上胰島素受體表達(dá)異常對(duì)葡萄糖刺激下的胰島素的第一時(shí)相分泌產(chǎn)生影響的研究很少。故本研究采用RNA干擾（RNA interference,RNAi）技術(shù)，使βTC-3細(xì)胞上胰島素受體mRNA表達(dá)下調(diào)，觀察其對(duì)葡萄

4、糖刺激下胰島素第一時(shí)相分泌量的影響，并分析其量效關(guān)系，為2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制研究提供新的資料。
　　目的：
　　建立小鼠胰島β細(xì)胞瘤細(xì)胞βTC-3胰島素受體下調(diào)模型，用含不同濃度葡萄糖的培養(yǎng)液孵育，檢測(cè)0、3、5、10分鐘時(shí)的胰島素分泌量，探討β細(xì)胞上胰島素受體表達(dá)對(duì)第一時(shí)相胰島素分泌的影響及其量效關(guān)系。
　　方法：
　　化學(xué)合成胰島素受體基因的4對(duì)特異siRNAs（實(shí)驗(yàn)組：siRNA-1組，siRNA-2組，s

5、iRNA-3組，siRNA-4組）和1對(duì)非特異siRNA（NC組）。通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體將siRNAs分別轉(zhuǎn)染βTC-3細(xì)胞，24h后熒光顯微鏡下觀察不同濃度siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率；同時(shí)應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)胰島素受體mRNA表達(dá)；放射免疫法測(cè)量細(xì)胞在高糖刺激下的胰島素第一時(shí)相分泌量。
　　結(jié)果：
　?、?0、100、150、200nmol/LsiRNA轉(zhuǎn)染βTC-3細(xì)胞24h后，轉(zhuǎn)染效率分別為(73.1±4.07)％、(92.

6、9±3.35)％、(90.8±4.02)％、(93.9±2.81)％，故選擇100nmol/L濃度作為siRNA轉(zhuǎn)染濃度。②轉(zhuǎn)染100nmol/LsiRNAs24h后，與對(duì)照組相比siRNA-1、2、3、4組βTC-3細(xì)胞胰島素受體mRNA表達(dá)分別下調(diào)了62％、78.8％、0％和7.4％。③葡萄糖刺激的胰島素一相分泌在5分鐘峰值時(shí)siRNA-1組較對(duì)照組下降約27.7％，siRNA-2組較對(duì)照組下降約28.6％，siRNA-3組較對(duì)照組