TNF-α對小鼠胰島β細胞胰島素分泌的影響及其機制的研究.pdf

1、目的:
　　腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)具有廣泛的生物活性，是重要的致炎因子和免疫調(diào)節(jié)因子，是激活脂肪細胞及單核巨噬細胞分泌的一種細胞因子。臨床實驗表明，TNF-α伴隨著糖尿病病情發(fā)展的整個過程，故動態(tài)檢測血清TNF-α水平可作為臨床監(jiān)測糖尿病病情變化的客觀指標，并為糖尿病病情提供臨床信息。腺甘酸活化蛋白激酶(Adenosine monophosphate-activated pr

2、oteinkinase，AMPK)是細胞內(nèi)能量守恒的感受器，當細胞內(nèi)AMP和ATP的比值升高到一定程度時，AMPK就會被激活，可在一定程度上調(diào)節(jié)血糖和血脂之間的水平。遺傳學和藥理學研究表明，AMPK是機體保持葡萄糖平衡所必需的。由于分子機制十分復雜，藥物分子激活AMPK是一個巨大的挑戰(zhàn)，但其激活能改善由2型糖尿病引起的代謝失衡。AMPK和MAPK(Mitogen-activated proteinkinases)信號傳導通路之間具有復雜

3、的相互作用。大量研究表明，MAPK/JNK又是AMPK信號通路的下游靶點之一。JNK(c-Jun N-terminal Kinases)途徑參與了機體內(nèi)一系列氧化應激和反應，可能與胰島素抵抗和胰島β細胞功能，炎癥因子的表達有密切的聯(lián)系。目前，對于選擇性地調(diào)節(jié)的JNK途徑是否通過TNF-α等其他信號通路影響胰島素分泌并不是很清楚。近年來研究顯示，JNK信號通路是胰島素抵抗等代謝紊亂及相關(guān)炎癥狀態(tài)的關(guān)注點，是改善和治療這些代謝紊亂狀態(tài)的重要

4、作用位點。本文探討不同濃度的TNF-α對MIN6小鼠胰島β細胞的增殖活性、細胞凋亡及胰島素分泌的影響，并初步探討TNF-α是否通過AMPK和JNK通路影響小鼠胰島β細胞胰島素分泌，能夠為AMPK、JNK抑制劑作為防治2型糖尿病的潛在新靶點提供可靠的理論基礎(chǔ)和應用依據(jù)。
　　方法:
　　(1)用不同濃度的TNF-α(0 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml)作用胰島MIN-6細

5、胞8小時和24小時，通過CCK-8法檢測細胞的增殖活性;
　　(2)通過AnnexinⅤ-FITC細胞凋亡試劑盒，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡的情況;
　　(3)分別用3 mM和30 mM葡萄糖刺激各組胰島MIN6細胞，用小鼠胰島素ELISA試劑盒檢測胰島素分泌水平;
　　(4)通過western blot方法檢測AMPK、p-AMPK、JNK、p-JNK的表達情況。
　　結(jié)果:
　　(1)TNF-α對MIN6的

6、細胞增殖活性的影響呈濃度與時間的反向依賴性。當TNF-α作用8小時，以對照組的存活率為100％，隨著濃度的增大，細胞的存活率逐漸降低依次為95.91±3.38％、89.73±4.00％、87.47±4.86％和80.78±3.54％;當TNF-α作用24小時，以對照組的存活率為100％，隨著濃度的增大，細胞的存活率逐漸降低依次為88.22±5.98％、81.06±7.26％、78.07±5.11％和75.61±4.35％;
　　(

7、2)TNF-α對MIN6的細胞凋亡的影響呈濃度與時間的正向依賴性。當TNF-α作用8小時，隨著濃度的增大，細胞的凋亡率逐漸增高依次為3.58±1.76％、8.88±2.15％、13.21±2.26％、15.53±2.98％和21.78±2.75％;當TNF-α作用24小時，隨著濃度的增大，細胞的凋亡率逐漸增高依次為3.92±1.82％、13.66±2.13％、20.16±5.71％、27.40±1.93％和34.77±4.90％;

8、>　　(3)TNF-α對MIN6的胰島素分泌量的影響呈濃度與時間的反向依賴性。當TNF-α作用8小時，隨著TNF-α濃度的增加，基礎(chǔ)狀態(tài)（3 mM葡萄糖）作用下，各組胰島素分泌量呈逐漸降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，高糖(30mM葡萄糖)作用下，各組胰島素分泌量逐漸降低依次為161.75±9.87pg/ml、144.45±12.08 pg/ml、132.63±10.36 pg/ml、129.22±13.18 pg/ml和1

9、17.91±8.60pg/ml;當TNF-α作用24小時，隨著TNF-α濃度的增加，基礎(chǔ)狀態(tài)作用下，各組胰島素分泌量呈逐逐漸降低依次為129.68±9.47pg/ml、114.42±11.75 pg/ml、113.44±16.91pg/ml、102.29±7.74 pg/ml和97.30±6.80 pg/ml，高糖作用下，各組胰島素分泌量逐漸降低依次為162.95±12.02 pg/ml、134.58±15.63 pg/ml、129.5

10、6±10.95 pg/ml、112.95±9.89 pg/ml和106.24±7.83 pg/ml;
　　(4)TNF-α作用MIN6細胞8小時和24小時，隨著TNF-α濃度的增加，各組AMPK、JNK蛋白的表達量無明顯改變，而p-AMPK蛋白的表達量呈遞減趨勢，p-JNK蛋白的表達量呈遞增趨勢。
　　結(jié)論:
　　不同濃度的TNF-α作用于小鼠胰島β細胞MIN6細胞后，隨著時間的增加及TNF-α濃度的增高，細胞存活率、