siRNA干擾CASK表達(dá)對(duì)胰島β細(xì)胞胰島素分泌的影響.pdf

1、目的：鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性絲氨酸蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent serineprotein kinase，CASK)在神經(jīng)突觸的形成、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。但其在胰島β細(xì)胞中的功能目前尚未明確。本研究利用體外培養(yǎng)的大鼠胰島p細(xì)胞系INS-1，以體內(nèi)主要游離飽和脂肪酸-棕櫚酸(palmitic acid，palm)為代表，觀察脂毒性對(duì)INS-1細(xì)胞CAS

2、K表達(dá)及鉀離子刺激胰島素分泌(potassium-stimulated insulin secretion，KSIS)功能的影響。轉(zhuǎn)染小分子RNA干擾片段(siRNA)抑制CASK基因的表達(dá)后，觀察INS-1細(xì)胞及大鼠胰島的KSIS功能的變化。
　　方法：1.體外培養(yǎng)大鼠INS-1細(xì)胞，觀察慢性脂肪酸處理對(duì)INS-1細(xì)胞CASK基因mRNA和蛋白表達(dá)的影響，及鉀離子刺激的胰島素分泌功能的影響。2.利用脂質(zhì)體Lipofectamin

3、e2000將針對(duì)靶基因CASK合成的五條特異性siRNA片段(siCASK-1，2，3，4，5)及對(duì)照組片段轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR及Western Blot檢測(cè)CASK基因及蛋白表達(dá)變化，進(jìn)行有效干擾片段的篩選。使用有效siRNA片段轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞及分離的大鼠胰島，檢測(cè)鉀離子刺激胰島素分泌功能的改變。
　　結(jié)果：脂肪酸處理INS-1細(xì)胞后：1.CASK的mRNA水平與對(duì)照組相比明顯降低(P<0.05，P<0.01)

4、；2.CASK的蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯降低(P<0.05，P<0.01)；3.KSIS功能與對(duì)照組相比明顯降低(P<0.05)。4.篩選得到有效干擾片段siCASK-5，轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞48h后，CASK的mRNA水平與對(duì)照組相比明顯降低(P<0.01)；5.CASK的蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯降低(P<0.05，P<0.01)；6.KSIS功能與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05，P<0.01)。7.siCASK-5轉(zhuǎn)染胰島4