血紅氧化酶-l對(duì)巨噬細(xì)胞活化因子清道夫受體的影響.pdf

1、背景：
　　冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病。巨噬細(xì)胞活化和泡沫細(xì)胞形成是動(dòng)脈粥樣硬化（AS）發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵步驟。最新研究發(fā)現(xiàn)，CD163是只存在單核巨噬細(xì)胞膜上的跨膜分子，在炎癥刺激的作用下可從膜上脫落形成可溶性的CD163(sCD163)，而 sCD163被認(rèn)為是巨噬細(xì)胞活化的標(biāo)志?；罨木奘杉?xì)胞通過其表面的清道夫受體（如SR-A、CD36、CXCL16、CD68等）攝取ox-LDL，形成富含脂質(zhì)的泡沫細(xì)胞

2、，泡沫細(xì)胞堆積形成脂質(zhì)條紋或脂質(zhì)斑塊，最終導(dǎo)致AS的形成和發(fā)展。
　　血紅素氧化酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）是一種內(nèi)源性的催化血紅素分解的限速酶，它通過催化降解血紅素生成等摩爾的CO、膽紅素、游離鐵離子，從而發(fā)揮其抗氧化、抗炎、抑制血管內(nèi)膜增生和血管擴(kuò)張的作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，CAD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞HO-1表達(dá)升高，且表達(dá)強(qiáng)度與臨床表型有關(guān)，說明HO-1在AS形成過程中發(fā)揮了有益的作用。但HO-1能否通過

3、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞上sCD163和清道夫受體（SR-A、CD36、CXCL16、CD68）的表達(dá)，影響巨噬細(xì)胞活化和泡沫細(xì)胞的形成還尚未見報(bào)道。
　　目的：
　　本研究將采用人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞為研究對(duì)象，通過構(gòu)建單核細(xì)胞來源性泡沫細(xì)胞模型，觀察HO-1對(duì)巨噬細(xì)胞活化標(biāo)志sCD163和清道夫受體（SR-A、CD36、CXCL16、CD68）的影響，探討HO-1在巨噬細(xì)胞活化和泡沫細(xì)胞形成中作用，為HO-1應(yīng)用于冠心病的預(yù)防和

4、治療提供新的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞，然后以100 nmol/L佛波酯（PMA）孵育48 h，誘導(dǎo)使其分化為巨噬細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞的形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞膜上CD14的表達(dá)。
　　2.用地塞米松（DXM）與THP-1源性巨噬細(xì)胞孵育24小時(shí)，使其膜上的CD163表達(dá)最大化，再用不同濃度LPS(10、100、1000、100

5、00 pg/mL)脂多糖（LPS）作用1小時(shí)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)和流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)LPS對(duì)sCD163和CD163的影響。
　　3.分別用HO-1誘導(dǎo)劑CoPP IX和HO-1抑制劑ZnPP IX預(yù)處理CD163高表達(dá)的THP-1源性巨噬細(xì)胞12小時(shí)后，再用1 ng/ml的LPS刺激1小時(shí)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)和流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)HO-1對(duì)LPS誘導(dǎo)的sCD163和CD163表達(dá)的影響。
　　

6、4.用不同濃度（0、25、50、100mg/L）ox-LDL與THP-1源性巨噬細(xì)胞共同孵育24小時(shí)，或用100mg/L的ox-LDL作用不同時(shí)間（0、12h、24h、48h），油紅O染色觀察巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形態(tài)，蛋白免疫印跡（Western Blot）方法檢測(cè)ox-LDL刺激后對(duì)清道夫受體（SR-A、CD36、CXCL16、CD68）和HO-1蛋白表達(dá)的影響。
　　5.分別用HO-1誘導(dǎo)劑CoPP IX和HO-1抑制劑ZnP

7、P IX預(yù)處理THP-1源性巨噬細(xì)胞12小時(shí)后，再用100 mg/L的ox-LDL孵育24小時(shí)，蛋白免疫印跡（Western Blot）方法檢測(cè)HO-1對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的清道夫受體（SR-A、CD36、CXCL16、CD68）蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1. PMA可使大部分的THP-1單核細(xì)胞誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞，并進(jìn)一步與ox-LDL孵育后可形成泡沫細(xì)胞。
　　2. LPS能引起THP-1巨噬細(xì)胞膜上CD163的

8、脫落，即使細(xì)胞培養(yǎng)液中sCD163的生成增多，巨噬細(xì)胞膜上CD163的表達(dá)減少。
　　3.誘導(dǎo)HO-1高表達(dá)能抑制LPS誘導(dǎo)的CD163的脫落，即增加巨噬細(xì)胞膜上CD163的表達(dá)，減少細(xì)胞培養(yǎng)液中的sCD163的生成。
　　4. ox-LDL能誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞內(nèi)HO-1的表達(dá)，并呈時(shí)間和濃度依賴性。
　　5. ox-LDL能增加THP-1源性巨噬細(xì)胞膜上清道夫受體（SR-A、CD36、CXCL16、CD68）