A類清道夫受體胞漿域結(jié)合多肽的功能研究.pdf

1、心血管疾病是世界范圍內(nèi)死亡的主要原因，也是導(dǎo)致勞動力喪失的主要原因之一。而動脈粥樣硬化(AS)是局部缺血發(fā)作，冠心病等心血管疾病的主要病理生理原因。因此AS已成為心血管疾病研究的重點和熱點領(lǐng)域。巨噬細胞在AS發(fā)生的早期及斑塊破裂等各個階段都起著重要的作用。巨噬細胞源性泡沫細胞被認為是“治療AS的靶點"。A類清道夫受體(scavenger receptor A，SR-A)是一種主要位于巨噬細胞膜表面的同源三聚體糖蛋白，能夠介導(dǎo)乙?；兔芏?/p>

2、脂蛋白(AcLDL)等配體不受負反饋調(diào)節(jié)地進入細胞，導(dǎo)致泡沫細胞形成。研究認為，SR-A的胞漿結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)受體介導(dǎo)的脂質(zhì)內(nèi)吞、細胞黏附以及受體在細胞表面的表達等過程。去除SR-A胞漿域的受體可以在細胞中表達并能結(jié)合乙酰化低密度脂蛋白(AcLDL)，但不能介導(dǎo)AcLDL進入細胞內(nèi)，細胞不能轉(zhuǎn)化為泡沫細胞。因此，推測SR-A的胞漿域可能是干預(yù)泡沫細胞形成的重要靶點。王曉花等人在前期實驗中利用SR-A的胞漿域為靶點篩選噬菌體多肽庫，篩選出與其相

3、互作用的小分子多肽H11。研究發(fā)現(xiàn)多肽H11可以抑制SR-A介導(dǎo)的THP-1巨噬細胞對脂質(zhì)的結(jié)合及內(nèi)吞。本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上探討多肽H11對SR-A功能如對泡沫細胞形成的影響，并且對其分子作用機制做進一步研究。 為了進一步研究多肽H11對SR-A介導(dǎo)的泡沫細胞形成的影響，我們用人工法合成多肽H11，并在其氨基端融合一穿膜肽TAT(RKKRRQRRR)，使得多肽H11可以進入細胞并與SR-A胞漿域相結(jié)合。用佛波酯(phorbo

4、l ester)誘導(dǎo)THP-1細胞，使之分化為巨噬細胞并在細胞表面大量表達SR-A。用多肽TAT-H11處理細胞30min后，再加入高濃度的AcLDL，以誘導(dǎo)泡沫細胞的形成。72h后對細胞進行油紅染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未加入多肽的細胞組相比，加入了多肽FAT-H11的細胞組其油紅染色區(qū)占整個細胞面積的比例減少了20％。此結(jié)果說明多肽TAT-H11能明顯抑制THP-1巨噬細胞轉(zhuǎn)化的泡沫細胞形成。在形態(tài)學(xué)上觀察多肽TAT-H11對THP-1巨噬細

5、胞的脂質(zhì)積聚影響后，我們進一步檢測了多肽。TAT-H11對泡沫細胞內(nèi)膽固醇酯積聚的影響。在用AcLDL負荷細胞后測定細胞內(nèi)的脂質(zhì)含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在加入多肽后，細胞內(nèi)的總膽固醇酯含量減少約17％，游離膽固醇含量無顯著性差異，而膽固醇酯含量減少了約36％。此結(jié)果表明多肽H11對于游離膽固醇的抑制并不明顯，它主要抑制了膽固醇酯在細胞內(nèi)的積聚。泡沫細胞的形成主要是由于細胞內(nèi)膽固醇酯的積聚引起的。因此我們可以得出結(jié)論，多肽可以抑制膽固醇酯在細胞內(nèi)的

6、積聚，泡沫細胞的形成受到抑制。為了解多肽H11對SR-A其它功能的可能影響，我們進一步檢測了多肽對SR-A在THP-1細胞內(nèi)表達的影響。在對THP-1細胞進行誘導(dǎo)之前，加入多肽TAT-H11使其進入細胞30min后，再加入PMA促使細胞分化表達SR-A。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當多肽TAT-H11存在時SR-A的蛋白表達受到抑制。且隨著加入多肽濃度的增加，SR-A蛋白表達抑制程度越大。當多肽濃度達到10μM時，SR-A的表達被抑制了40％.為了進一步分

7、析多肽對SR-A蛋白表達的抑制是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平還是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后翻譯水平，我們用RT-PCR法檢測多肽對SR-A的mRNA表達是否有影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在多肽存在時，SR-A的mRNA表達被抑制了.說明了多肽對SR-A表達的影響是在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生的。SR-A在與多肽TAT-H11結(jié)合以后減少了對AcLDL攝取，膽固醇酯的積聚減少，泡沫細胞的形成受到抑制。其中的機制可能是多肽在與SR-A結(jié)合后影響了SR-A介導(dǎo)的某條下游信號通路，從而影響了SR-

8、A對脂質(zhì)的攝取。有文獻報道信號分子JNK2磷酸化的抑制可以減少動脈粥樣硬化斑塊的形成。因此，我們加入配基AcLDL刺激THP-1巨噬細胞，誘導(dǎo)SR-A介導(dǎo)的下游信號通路的發(fā)生，并用Western Blot法檢測多肽TAT-H11對信號分子JNK MAPK以及其它信號分子如ERK/P38 MAPK磷酸化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)多肽H11對JNK2的磷酸化有抑制作用，對其他信號分子的磷酸化則無影響。表明多肽對SR-A介導(dǎo)的脂質(zhì)內(nèi)吞的抑制可能是通過對