生長激素、胰島素對樹突狀細(xì)胞免疫表型和免疫功能的影響研究.pdf

1、腫瘤生物治療(Biotherapy)是惡性腫瘤綜合治療中重要的手段之一,它以獨(dú)特的療效和近乎不存在的毒副作用越來越受到患者和腫瘤工作者的青睞,是應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)及其產(chǎn)品進(jìn)行腫瘤防治的新療法,它通過調(diào)動宿主的天然防衛(wèi)機(jī)制或給予天然(或基因工程)產(chǎn)生的靶向性很強(qiáng)的物質(zhì)來取得抗腫瘤的效應(yīng)。腫瘤生物治療包括體細(xì)胞療法與細(xì)胞因子療法、腫瘤疫苗與樹突狀細(xì)胞(dendriticcells,DCs)、腫瘤分子靶向治療、放射免疫靶向治療、腫瘤基因治療和生

2、物化療等。DCs誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicity t lymphocyte,CTL)是目前研究的熱點之一,也是體內(nèi)外實驗研究證實療效明確的生物治療方法之一。DCs用于腫瘤治療已進(jìn)入Ⅰ和Ⅱ期臨床研究,所涉及的腫瘤包括惡性黑色素瘤、B細(xì)胞淋巴瘤、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、尤文肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、腎細(xì)胞癌、肺癌、胃腸道惡性腫瘤、乳腺癌等,并且取得了令人鼓舞的療效。
　　 DCs是體內(nèi)最有效的專職抗原遞呈細(xì)胞(antig

3、en presenting cell,APC),是識別病原侵入的第一道防線,機(jī)體的免疫識別首先由DCs捕獲、加工和處理抗原,再將抗原遞呈給T、B淋巴細(xì)胞,從而引發(fā)一系列免疫應(yīng)答,在體內(nèi)發(fā)揮強(qiáng)大的免疫監(jiān)視功能。
　　 但是以DCs為基礎(chǔ)的腫瘤生物治療在體外對腫瘤細(xì)胞的殺傷率相對比較低,分析可能的因為有:一、誘導(dǎo)獲得的DCs功能活性低和/或數(shù)量少,不能有效地將抗原呈遞給并激活T淋巴細(xì)胞；二、獲得的CTL細(xì)胞功能活性低,細(xì)胞毒性不足以

4、有效地殺傷腫瘤細(xì)胞；三、CTL和腫瘤細(xì)胞作用的環(huán)境中后,無具有“催化作用”的生物活性物質(zhì)催化/放大這種殺傷活性。
　　 設(shè)想有一些生物活性物質(zhì),可以打開誘導(dǎo)獲取DCs的“限速閘門”而發(fā)揮生物放大效應(yīng),快速獲得大量的具有免疫激活效應(yīng)的DCs；設(shè)想有一些生物活性物質(zhì)能在DCs和T淋巴細(xì)胞作用時發(fā)揮“催化放大”功能,高效呈遞抗原,有效激活T淋巴細(xì)胞成為具有高級殺傷功能的CTL細(xì)胞；設(shè)想有一些生物活性物質(zhì)能在CTL與腫瘤細(xì)胞接觸的局部環(huán)

5、境中發(fā)揮“酶促”效應(yīng),極度放大殺傷活性。
　　 人體內(nèi)的激素是由內(nèi)分泌系統(tǒng)的內(nèi)分泌細(xì)胞所分泌的,可傳遞信息的高效能生物活性物質(zhì),分為胺類、多肽與蛋白質(zhì)類和脂類激素3大類,近50種之多。激素是體內(nèi)的最高效能的生物活性物質(zhì),在生理狀態(tài)下,血液中的激素濃度都很低,多為納摩爾(nmol/L),甚至為皮摩爾(pmol/L)數(shù)量級,但是激素與細(xì)胞的受體結(jié)合后,可引發(fā)一系列酶促反應(yīng),并逐級擴(kuò)大其后續(xù)效應(yīng),形成效能極高的生物放大系統(tǒng),發(fā)揮出激素

6、類物質(zhì)的生物放大效應(yīng)。本研究分為以下二部分:
　　 一、在體外觀察、檢測了不同濃度的生長激素對DCs免疫表型和免疫功能的影響,并觀察了生長激素受體拮抗劑培維索孟對生長激素修飾DCs效應(yīng)的拮抗效應(yīng)。
　　 二、在體外觀察、檢測了不同濃度的胰島素對DCs免疫表型和免疫功能的影響,并檢測了胰島素修飾下獲得的DCs誘導(dǎo)的CTL對胰腺癌細(xì)胞株的體外殺傷活性。
　　 第一部分生長激素對臍血來源樹突狀細(xì)胞成熟狀態(tài)的影響

7、　　 目的在體外檢測生長激素(growth hormone,GH)對臍血來源樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)的免疫表型和功能狀態(tài)的影響。
　　 方法：從新鮮臍帶血中分離出單核細(xì)胞,應(yīng)用白細(xì)胞介素4和粒巨噬集落刺激因子誘導(dǎo)刺激單核細(xì)胞,不同濃度的GH做為修飾因子修飾DCs誘導(dǎo)過程,設(shè)立空白對照組陰性對照組(氫化可的松作為修飾因子)和陽性對照組(以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作為修飾因

8、子)；觀察DCs形態(tài)、數(shù)目、生長狀態(tài),流式細(xì)胞儀檢測DCs的免疫表型,ELISA方法測定DCs上清液中白細(xì)胞介素-12,自體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)測定其功能狀態(tài)；應(yīng)用培維索孟作為GH拮抗劑觀察拮抗后的效應(yīng)。
　　 結(jié)果：臍血貼壁的單核細(xì)胞在細(xì)胞因子IL-4、GM-CSF和GH的誘導(dǎo)下可以分化為成熟DCs,不同濃度(5ug/L～100ug/L)GH均可顯著上調(diào)DCs細(xì)胞表面HLA-DR、CD1α、CD80和CD83分子表達(dá)的陽性率(P<

9、0.05),明顯提高DCs分泌IL-12的能力(P<0.05),DCs對自體淋巴細(xì)胞的激活功能明顯增強(qiáng)(P<0.05)；培維索孟能有效拮抗GH對DCs的上述效應(yīng)。
　　 結(jié)論：(1).GH可明顯促進(jìn)DCs的誘導(dǎo)過程,修飾加速DCs的成熟并提高細(xì)胞表面共刺激分子表達(dá),增強(qiáng)DCs IL-12分泌和激發(fā)自身淋巴細(xì)胞增殖能力。(2).GH修飾DCs的誘導(dǎo)獲取過程,可獲得更高比例成熟型DCs細(xì)胞群,并且該DCs細(xì)胞群具有更強(qiáng)的免疫激活功能

10、。(3).GH對DCs免疫特征和功能的修飾與GH的濃度有一定范圍內(nèi)的正相關(guān)性。(4).GH對DCs免疫特征和功能的修飾作用是可控的,可逆的,可被生長激素拮抗劑培維索孟有效拮抗。
　　 第二部分胰島素對臍血來源樹突狀細(xì)胞功能狀態(tài)及誘導(dǎo)的CTL殺傷胰腺癌細(xì)胞株的影響
　　 目的探討胰島素(insulin,In)對臍血來源樹突狀細(xì)胞(DCs)的免疫功能狀態(tài)和DCs誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicity t lymp

11、hocyte,CTL)殺傷胰腺癌細(xì)胞株活性的影響。
　　 方法：從新鮮臍帶血中分離出單核細(xì)胞,應(yīng)用IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)刺激單核細(xì)胞,不同濃度的In做為修飾因子修飾DCs誘導(dǎo)過程,設(shè)立空白對照組陰性對照組(氫化可的松作為修飾因子)和陽性對照組(以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作為修飾因子)；觀察DCs形態(tài)、數(shù)目、生長狀態(tài),流式細(xì)胞儀檢測DCs的免疫表型,ELISA方法測定DCs上清液中IL-12,自體

12、混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)測定其功能狀態(tài)；In修飾后的DCs誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞成為CTL細(xì)胞,比較測定CTL對2種胰腺癌細(xì)胞株P(guān)atu-8988和AsPC-1的殺傷活性。
　　 結(jié)果：臍血來源的單核細(xì)胞在細(xì)胞因子IL-4、GM-CSF誘導(dǎo)和In的修飾下成功分化成為DCs,不同濃度(2.5mg/L～25mg/L)In可顯著上調(diào)DCs細(xì)胞表面HLA-DR、CD1α、CD80、CD83分子表達(dá)的陽性率(P<0.05),明顯提高DCs分泌IL-12的

13、能力(P<0.05),DCs對自體淋巴細(xì)胞的激活功能明顯增強(qiáng)(P<0.05),經(jīng)In修飾的DCs誘導(dǎo)出的CTL細(xì)胞殺傷胰腺癌細(xì)胞株的活性顯著增強(qiáng)(P<0.05)。
　　 結(jié)論：.(1).In可明顯促進(jìn)DCs的誘導(dǎo)過程,修飾加速DCs的成熟并提高細(xì)胞表面共刺激分子表達(dá),增強(qiáng)DCs IL-12分泌和激發(fā)自身淋巴細(xì)胞增殖能力。(2).In修飾DCs的誘導(dǎo)獲取過程,可獲得更高比例成熟型DCs細(xì)胞群,并且該DCs細(xì)胞群具有更強(qiáng)的免疫激活功