血管緊張素Ⅱ?qū)θ送庵軉魏思?xì)胞源樹(shù)突狀細(xì)胞免疫功能的影響及機(jī)制研究.pdf

1、[背景和目的] 目前認(rèn)為AS是一種慢性炎癥反應(yīng)過(guò)程，增厚的病灶是血管壁內(nèi)結(jié)締組織對(duì)致炎因子的一種增生性反應(yīng)，是各種特異的細(xì)胞、分子對(duì)外源性的危險(xiǎn)因子與抗原的反應(yīng)．樹(shù)突狀細(xì)胞是一種廣泛分布于機(jī)體各組織的抗原遞呈細(xì)胞，近來(lái)認(rèn)為DC可能處于AS免疫反應(yīng)的中心地位．大量的研究發(fā)現(xiàn)腎素一血管緊張素系統(tǒng)可能參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ通過(guò)AT1受體刺激炎癥介質(zhì)的分泌、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)ox-LDL的攝取、產(chǎn)生氧自由

2、基和影響纖溶功能等多方面參與動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程。其中刺激炎癥介質(zhì)的分泌是最重要的機(jī)制之一，甚至有研究者提出AngⅡ?yàn)樘厥獾募?xì)胞因子．以往的研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ?qū)Χ喾N斑塊內(nèi)的細(xì)胞成分(內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)均有促炎癥介質(zhì)分泌的作用：刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子及增加單核細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮的黏附而促進(jìn)斑塊的發(fā)展，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MMP-2；誘導(dǎo)單核或巨噬細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基；誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞分泌IL-6、MCP-1，促進(jìn)遷移。而Ang Ⅱ?qū)乖f呈細(xì)胞D

3、C的研究則較少，其具體的作用及機(jī)制尚不清楚．有研究曾報(bào)道DC表達(dá)血管緊張素原、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、血管緊張素Ⅱ受體隨其成熟而改變，推測(cè)RAS系統(tǒng)可能促進(jìn)DC表達(dá)炎癥因子。AngⅡ促進(jìn)單核細(xì)胞向DC的分化，ARB氯沙坦能阻斷這種作用而使單核細(xì)胞向巨噬樣細(xì)胞分化。作為RAS系統(tǒng)中居于核心位置的AngⅡ能否作為致AS抗原物誘導(dǎo)DC的免疫成熟，從而增強(qiáng)激活T細(xì)胞的能力，促進(jìn)斑塊的形成，目前尚無(wú)定論．如果AngⅡ能誘導(dǎo)DC的免疫成熟，促進(jìn)炎癥介質(zhì)的

4、分泌，其機(jī)制又如何?本研究的目的是利用體外培養(yǎng)人單核細(xì)胞源性的樹(shù)突狀細(xì)胞，評(píng)價(jià)AngⅡ?qū)C免疫功能的影響，并對(duì)其中的機(jī)制進(jìn)行初探，為防治動(dòng)脈粥樣硬化提供新的思路。 [實(shí)驗(yàn)方法] 1.細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：用淋巴細(xì)胞分離液從健康成人外周血白細(xì)胞懸液分離單個(gè)核細(xì)胞，再用CD14+磁殊分選出純度大于98％的CD14+單核細(xì)胞，用含20ng／ml rhGM-CSF、10ng／ml rhlL-4的RPM11640培養(yǎng)基培養(yǎng)，第5天收集

5、懸浮細(xì)胞作為未成熟DC(immature DC，imDC)，加100ng／ml的LPS繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)收集起來(lái)即為成熟DC(mature DC，mDC)． 2.流式細(xì)胞學(xué)測(cè)定DC表面分子的表達(dá)． 3.混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)測(cè)定DC的促淋巴細(xì)胞增殖的能力。 4.吞噬實(shí)驗(yàn)測(cè)定DC的吞噬功能。 5.ELISA測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子。 6.半定量RT-PCR測(cè)定樹(shù)突狀細(xì)胞趨化因子的表達(dá)。 7.采用W

6、estem印跡測(cè)定磷酸化ERK1／2、p38及TLR4的表達(dá)。 8.采用EMSA法測(cè)定核內(nèi)NF-kB活性水平。 [結(jié)果] 1.Ang Ⅱ組細(xì)胞表達(dá)CD40較對(duì)照組增高，CD86、CD83、HLA-DR的表達(dá)則無(wú)明顯差異，V+AngⅡ組CD40與對(duì)照組無(wú)差異。LPS刺激下，AngⅡ組與對(duì)照組細(xì)胞表面分子的表達(dá)無(wú)明顯差異． 2.AngⅡ組DC的吞噬、促異種T淋巴細(xì)胞增殖的能力與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。LPS刺激

7、下，AngⅡ組子代T細(xì)胞比例高于對(duì)照組，V+AngⅡ組與對(duì)照組無(wú)差異。 3.AngⅡ干預(yù)后的DC培養(yǎng)上清中IL-6、TNF-α明顯高于對(duì)照組，Valsartan能抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的IL-6、TNF-α分泌．LPS刺激下，AngⅡ組DC培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-12均高于對(duì)照組，V+AngII組與對(duì)照組無(wú)差異． 4.AngⅡ干預(yù)后的DC表達(dá)MCP-1、RANTES、MIP-1α增加，Valsartan能抑制AngⅡ誘

8、導(dǎo)的MCP-1、MIP-1α表達(dá)，但不抑制RANTES的表達(dá)．LPS刺激下，AngⅡ組DC MCP-1、RANTES、MIP-1α、IP-10的表達(dá)均高于對(duì)照組，V+Ang II組與對(duì)照組無(wú)差異。 5.AngⅡ刺激磷酸化ERK1／2、p38的表達(dá)，ERK1／2、p38的抑制劑能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的IL-6、TNF-α的分泌以及MCP-1、RANTES、MIP-1α的表達(dá)． 6.AngⅡ可顯著增加DC NF-kB的活化，Va

9、lsartan能抑制AngII誘導(dǎo)的NF-kB活化。 7.LPS刺激下，AngⅡ組5min、15min的磷酸化ERKl／2的水平高于對(duì)照組，Valsartan能抑制Ang Ⅱ增強(qiáng)的磷酸化ERK1／2表達(dá)。Ang Ⅱ組與對(duì)照組磷酸化p38的水平無(wú)明顯差異． 8.濃度為0.0001-1μmol／L的AngⅡ干預(yù)24h，TLR4蛋白和膜表面蛋白的表達(dá)明顯增加，0.1μmol／L達(dá)到高峰，干預(yù)不同的時(shí)間，12h開(kāi)始增加，24h達(dá)

10、到高峰，呈明顯的濃度時(shí)間依賴性。Valsartan能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的TLR4表達(dá)。ERK1／2和p38的抑制劑不能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的TLR4表達(dá)。 [結(jié)論] 1.血管緊張素Ⅱ能增加DC表面CD40的表達(dá)，但不是DC典型的成熟誘導(dǎo)劑． 2.血管緊張素Ⅱ通過(guò)AT1受體，ERK1／2、p38信號(hào)通路以及NF-kB活化誘導(dǎo)DC分泌IL-6和TNF-α，促進(jìn)MCP-1和MIP-1α的表達(dá)． 3.血管緊張素Ⅱ可能通

11、過(guò)AT2受體，ERK1／2、p38信號(hào)通路以及NF-kB活化，促進(jìn)RANTES的表達(dá)。 4.血管緊張素Ⅱ增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的對(duì)異種T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌和趨化因子的表達(dá)，提示血管緊張素Ⅱ能增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的DC免疫功能． 5.血管緊張素Ⅱ增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的DC免疫功能，可能通過(guò)AT1受體． 6.血管緊張素Ⅱ增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的ERK1／2活化，對(duì)p38的活化影響不大． 7.血管緊張素Ⅱ通過(guò)