阻斷腎素血管緊張素系統(tǒng)對(duì)胰島β細(xì)胞功能的效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 近年來(lái)腎素血管緊張素系統(tǒng)與2型糖尿病的關(guān)系日益得到關(guān)注，RAS在胰島β細(xì)胞功能障礙發(fā)生中的作用及其干預(yù)價(jià)值成為2型糖尿病防治研究的熱點(diǎn)之一。本課題通過(guò)長(zhǎng)期高脂高熱量飲食構(gòu)建胰島素抵抗大鼠模型，以高脂飲食加小劑量鏈尿佐菌素腹腔注射構(gòu)建糖尿病大鼠模型，觀察在糖尿病發(fā)病的不同階段阻斷RAS對(duì)胰島β細(xì)胞功能的保護(hù)效應(yīng)及機(jī)制，及其對(duì)STZ致糖尿病發(fā)生率的影響，并通過(guò)體外對(duì)β細(xì)胞系INS-1細(xì)胞的培養(yǎng)及處理，探討RAS活化參與

2、β細(xì)胞功能損害的分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 (1)阻斷RAS對(duì)胰島素抵抗大鼠胰島β細(xì)胞功能的效應(yīng)及機(jī)制，及其對(duì)STZ致糖尿病發(fā)生率的影響：90只8周齡雄性Wistar 大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和胰島素抵抗造模組。胰島素抵抗造模組給予高脂高熱量飲食喂養(yǎng)16周，隨機(jī)分為高脂對(duì)照組，培哚普利干預(yù)組，替米沙坦干預(yù)組，共干預(yù)8 周。為了觀察在胰島素抵抗階段阻斷RAS對(duì)STZ致糖尿病發(fā)生率的影響，分別從高脂對(duì)照組及替米沙坦干預(yù)組

3、中隨機(jī)選擇15只大鼠作為高脂+小劑量STZ 腹腔注射組及替米沙坦干預(yù)+小劑量STZ腹腔注射組，禁食10-12h，以20mg/kg的劑量腹腔注射STZ，1周后以非同日2次隨機(jī)血糖≥16.7mmol/l者為糖尿病大鼠，繼續(xù)喂養(yǎng)周。
　　 (2)阻斷RAS對(duì)糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞功能的效應(yīng)及機(jī)制研究：50只8周齡雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和糖尿病造模組。糖尿病組以高脂高熱量飲食喂養(yǎng)8周后予小劑量ST腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病，納入標(biāo)

4、準(zhǔn)同上，隨機(jī)分為糖尿病組、ACEI干預(yù)組、ARB干預(yù)組，共干預(yù)8周。
　　 (3)RAS參與β細(xì)胞功能損害的相關(guān)分子機(jī)制研究：體外培養(yǎng)β細(xì)胞系INS-1細(xì)胞，分別用不同濃度葡萄糖處理不同時(shí)間，觀察其對(duì)INS-1細(xì)胞血管緊張素Ⅱ受體1表達(dá)的影響；用不同濃度的Ang Ⅱ處理24h，觀察其對(duì)INS-1細(xì)胞凋亡、功能以及胰島素信號(hào)分子的影響。動(dòng)物研究中胰島結(jié)構(gòu)、β細(xì)胞內(nèi)胰島素含量、胰島細(xì)胞凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激、胰島微血管密度及RAS表達(dá)

5、采用免疫組化或反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)，胰島功能采用靜脈葡萄糖耐量試驗(yàn)與靜脈胰島素釋放試驗(yàn)檢測(cè)，胰島素敏感性采用高胰島素正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)檢測(cè)；體外研究中INS-1細(xì)胞AT1 R及胰島素基因表達(dá)采用RT-PCR檢測(cè)，細(xì)胞活性、凋亡及胰島素信號(hào)分子分別采用MTT法、免疫熒光與流式細(xì)胞儀及western-blot法檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 1. 胰島素抵抗階段阻斷RAS對(duì)胰島β細(xì)胞功能的效應(yīng)及機(jī)制，及其對(duì)STZ 致糖尿病發(fā)生

6、率的影響
　　 1.1 長(zhǎng)期高脂高熱量飲食喂養(yǎng)大鼠胰島素敏感性及胰島β細(xì)胞功能
　　 與正常對(duì)照組相比，高脂對(duì)照組穩(wěn)態(tài)葡萄糖輸注率顯著降低，說(shuō)明FC組出現(xiàn)了明顯的胰島素抵抗；FC組胰島增生肥大，胰島內(nèi)胰島素相對(duì)含量較NC組顯著降低，提示FC組大鼠β細(xì)胞內(nèi)胰島素儲(chǔ)備不足；胰島素陽(yáng)性細(xì)胞核密度也有減少趨勢(shì)，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；葡萄糖負(fù)荷后第一時(shí)相胰島素分泌高峰延遲，0-10min 胰島素曲線下面積低于NC組，但是10-60

7、minAUCI超過(guò)NC組68.8%，提示FC組大鼠胰島素第一時(shí)相分泌不足，而出現(xiàn)第二時(shí)相異常高分泌。
　　 1.2 胰島素抵抗大鼠胰島內(nèi)RAS表達(dá)、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡
　　 與NC組比較，F(xiàn)C組AT1 R mRNA相對(duì)表達(dá)量增加了1.16倍，白細(xì)胞介素1β相對(duì)表達(dá)量增加了1.95倍，核因子κB相對(duì)濃度增加了20.5%，胰島內(nèi)凋亡信號(hào)分子Caspase-3 相對(duì)表達(dá)量增加了19.1%，單位胰島面積TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加

8、了2.43倍。
　　 1.3 阻斷RAS對(duì)胰島素抵抗大鼠胰島β細(xì)胞功能的影響
　　 藥物干預(yù)后，培哚普利干預(yù)組、替米沙坦干預(yù)組IRC較FC組明顯增加，分別為（-4.99±0.12）與（-4.87±0.09）；ICD也有所增加，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AUCI分別下降了15.6%、17.3%，AUCI及AUCI也有所下降，但差異無(wú)顯著性。說(shuō)明阻斷RAS具有增加胰島素抵抗大鼠β細(xì)胞內(nèi)胰島素含量及部分改善胰島素分泌模型的的效應(yīng)。

9、FP組、FT組之間差異均無(wú)顯著性。
　　 1.4 阻斷RAS對(duì)胰島素抵抗大鼠胰島內(nèi)炎癥及細(xì)胞凋亡的效應(yīng)
　　 與FC組相比，F(xiàn)P組、FT組胰島內(nèi)AT1 R mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低，IL-1 β相對(duì)表達(dá)量降低了22.4%、28.5%；NF-KB相對(duì)含量分別下降了20.1%、22.8%（均P<0.01）；Caspase-3相對(duì)表達(dá)量分別降低了15.5%、17.7%；單位胰島面積TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別下降了60.0%及

10、67.4%.說(shuō)明阻斷RAS可以顯著降低胰島素抵抗大鼠胰島內(nèi)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡水平。FP組、FT組之間差異均無(wú)顯著性。
　　 1.5 在胰島素抵抗階段阻斷RAS對(duì)STZ致糖尿病發(fā)生率的影響
　　 與高脂+STZ腹腔注射組比較，替米沙坦干預(yù)+ST腹腔注射組糖尿病的發(fā)生率顯著降低，分別為80.0%、33.3%。兩組平均空腹血糖也有顯著差異。
　　 2. 糖尿病階段阻斷RAS對(duì)胰島β細(xì)胞功能的效應(yīng)及機(jī)制
　　 2

11、.1 高脂飲食加小劑量STZ 腹腔注射構(gòu)建的糖尿病大鼠模型胰島結(jié)構(gòu)與功能
　　 與正常對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠胰島形態(tài)不規(guī)則，邊界模糊，結(jié)構(gòu)紊亂，IRC顯著下降；胰島素第一時(shí)相分泌高峰延遲、峰值降低，AUCI下降了67.0%，早期胰島素分泌指數(shù)降低了81.1％
　　 2.2 糖尿病大鼠胰島內(nèi)RAS表達(dá)、氧化應(yīng)激、微血管密度及細(xì)胞凋亡
　　 與NC組比較，DM組胰島內(nèi)血管緊張素原mRNA表達(dá)顯著增加；誘導(dǎo)型一氧化氮

12、合酶相對(duì)濃度增加了10.3%，提示糖尿病狀態(tài)下胰島局部氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)；胰島微血管密度降低了71.4%，低氧誘導(dǎo)因子1αmRNA相對(duì)表達(dá)量增加了1.19倍，提示糖尿病大鼠胰島處于相對(duì)或絕對(duì)乏氧狀態(tài)；單位面積胰島細(xì)胞凋亡數(shù)增加了2.14倍。
　　 2.3 阻斷RAS對(duì)糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞功能的影響
　　 藥物干預(yù)后，ACEI組、ARB組胰島結(jié)構(gòu)有所改善，IRC較DM組明顯增加，AUCI分別增加了41.2%和33.1%，EI

13、SI分別增加了1.84倍和1.74倍，說(shuō)明阻斷RAS后糖尿病大鼠胰島素第一時(shí)相分泌有所恢復(fù)。AE組、AR組之間差異均無(wú)顯著性。
　　 2.4 阻斷RAS對(duì)糖尿病大鼠胰島氧化應(yīng)激、微血管密度及細(xì)胞凋亡的影響
　　 AE組和AR組胰島內(nèi)iNOS含量較DM組分別下降了16.5%、18.2%；MVD分別增加了62.5%與75.0%，HIF-1α基因表達(dá)分別下降了27.2%與29.0%；單位面積胰島凋亡細(xì)胞數(shù)分別下降了29.0%、

14、36.2%。AE組、AR組之間差異均無(wú)顯著性。
　　 3. RAS參與β細(xì)胞功能損害的相關(guān)分子機(jī)制
　　 3.1不同糖濃度處理不同時(shí)間INS-1細(xì)胞AT1R基因表達(dá)變化
　　 以5.6 mmol/l的葡萄糖培養(yǎng)24h作為基礎(chǔ)對(duì)照組，5.6mG培養(yǎng)48h AT1R mRNA表達(dá)無(wú)明顯改變；16.7mG培養(yǎng)24h后AT1 R mRNA表達(dá)增多，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，培養(yǎng)48h后AT1 R mRNA表達(dá)較對(duì)照組增加了0.

15、72倍；33.3mG培養(yǎng)24h，AT1 R表達(dá)水平較對(duì)照組增加了1.33倍，培養(yǎng)48h后，AT1 R mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步增加，為對(duì)照組的2.6倍。
　　 3.2不同濃度Ang Ⅱ處理24h對(duì)INS-1細(xì)胞胰島素分泌功能的影響
　　 以5.6mG 培養(yǎng)24h作為對(duì)照組，不同濃度Ang Ⅱ處理組基礎(chǔ)狀態(tài)下的胰島素分泌無(wú)明顯改變，但葡萄糖刺激后胰島素分泌分別較對(duì)照組下降了7.9%、21.1%、26.3%和34.2%。

16、>　　 3.3不同濃度Ang Ⅱ處理24h對(duì)INS-1細(xì)胞凋亡的影響
　　 分組同上，觀察INS-1細(xì)胞的凋亡率變化。5.6mG培養(yǎng)48h，細(xì)胞凋亡率為5.7%，0.1 nmol/l Ang Ⅱ培養(yǎng)24h組細(xì)胞凋亡率為10.3%，較對(duì)照組增加，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組隨 Ang Ⅱ濃度增加，細(xì)胞凋亡率均顯著增加。
　　 3.4不同濃度Ang Ⅱ處理24h對(duì)INS-1細(xì)胞胰島素信號(hào)分子的影響
　　 以5.6

17、mG培養(yǎng)24h 為對(duì)照組，未檢測(cè)到磷酸化的胰島素受體底物絲氨酸270位點(diǎn)的表達(dá)，而加入不同濃度Ang Ⅱ培養(yǎng)24h后，可檢測(cè)到磷酸化IRS-ser270蛋白表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量分別為0.31，0.72；0.1nmol/l Ang Ⅱ處理24h后，蛋白激酶B絲氨酸473位點(diǎn)磷酸化水平較對(duì)照組下降了20.1%，100nmol/l Ang Ⅱ培養(yǎng)24后，PKB-ser473磷酸化水平進(jìn)一步降低，較對(duì)照組下降了30.2%。
　　 結(jié)論：<

18、br>　　 RAS活化與糖尿病發(fā)病進(jìn)程中胰島β細(xì)胞功能損害密切相關(guān)，葡萄糖具有濃度及時(shí)間依賴性地上調(diào)胰島RAS活性的效應(yīng)。RAS活化可能通過(guò)誘發(fā)胰島炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、局部血流動(dòng)力學(xué)異常、胰島素受體后信號(hào)通路損害及細(xì)胞凋亡等機(jī)制損傷β
　　 細(xì)胞存活與功能。早期阻斷RAS 具有保護(hù)胰島β細(xì)胞功能的作用，可以顯著降低胰島素抵抗大鼠STZ 致糖尿病的發(fā)生率；在糖尿病階段阻斷RAS，對(duì)胰島β細(xì)胞存活與功能仍然具有明顯的保護(hù)效應(yīng)。阻斷