血管緊張素Ⅱ?qū)ψ慵毎允傻挠绊懠皺C制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　足細胞(podocyte)作為一種終末高度分化細胞,是維持腎小球濾過屏障(glomerular filtration barrier,GFB)的最關(guān)鍵部分,對防止血漿白蛋白和大分子蛋白的濾過起重要作用。足細胞的損傷和丟失是導(dǎo)致腎臟疾病發(fā)展和腎功能衰竭的主要因素。
　　自噬(autophagy)是存在于酵母至人類等真核生物細胞中的一種高度保守的、維持細胞自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要胞內(nèi)降解機制,通過溶酶體蛋白降解

2、途徑清除受損的細胞器和細胞內(nèi)毒性物質(zhì),以“垃圾處理廠”及“廢品回收站”的方式為蛋白質(zhì)的合成和細胞器的更新提供原料,從而維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)及細胞的完整性。作為一種終末高度分化細胞,足細胞的存活主要依賴于自噬吞噬體有效的清除不需要和損傷的蛋白質(zhì)和細胞器,以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及細胞正常生命活動,但過度的自噬會導(dǎo)致細胞發(fā)生“自噬性程序性死亡”。定位在前自噬體和自噬體膜表面的微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-Associated Pro

3、tein1 Light Chain3,LC3)參與了自噬體的形成,是目前檢測自噬水平的特異性標記物。LC3以LC3-I和LC3-II兩種形式存在于細胞中,發(fā)生自噬時以細胞溶質(zhì)形式存在的LC3-I經(jīng)包含Atg7和Atg3在內(nèi)的泛素樣修飾加工后,與自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine,PE)結(jié)合,LC3-I即轉(zhuǎn)化為分子量較小的LC3-II并結(jié)合在自噬體膜上。Beclin-1是一種與自噬相關(guān)的抑癌基因

4、,與酵母自噬基因Atg6同源,通過與III型磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase class III,PI3KC3)結(jié)合形成PI3K復(fù)合物,從而調(diào)節(jié)自噬體的形成。
　　腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensinsystem,RAS)在腎臟疾病的病理生理進程中起重要作用,血管緊張素II(angiotensin II,Ang II)作為RAS系統(tǒng)的主要效應(yīng)分子,可通過與細胞上的血管緊

5、張素受體(angiotensin receptor, ATR)作用,引起細胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷,近年來發(fā)現(xiàn)其在腎臟的局部濃度比系統(tǒng)水平高出60~100倍,,說明AngII對腎臟細胞的直接生物學(xué)效應(yīng)可能更為關(guān)鍵。
　　Rho激酶又稱為Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(rho-associated kinase,ROCKs),是 Rho家族小 G蛋白成員 RhoA下游最主要、最具特征性的信號分子,屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員。多種炎

6、癥介質(zhì)和細胞因子能激活Rho激酶信號通路,如轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)、血小板源性生長因子(platelet derived growth factor,PDGE)、白介素1(interleukin-1,IL-1)、內(nèi)皮素1(endothelin-1, ET-1)等。研究證實Rho激酶信號途徑也可以通過AngII激活,但其具體機制仍然不清。Rho激酶途徑具有調(diào)節(jié)細胞收縮、遷移

7、、增生、凋亡等功能,在多種腎臟疾病的發(fā)病機制中起重要作用。法舒地爾(fasudil)作為 Rho激酶抑制劑,在腎臟損傷中的保護作用被廣泛的證實,如能阻止 TGF-β1誘導(dǎo)小管上皮細胞分化成成纖維細胞,防止小管間質(zhì)發(fā)生纖維化;通過抑制Rho激酶信號途徑,降低炎癥因子和細胞因子的分泌,減輕氧化應(yīng)激和蛋白尿,及改善腎臟血流動力學(xué)來延緩糖尿病腎病的進展等。目前研究發(fā)現(xiàn),Rho激酶通路在調(diào)節(jié)自噬中起重要作用,Aditi等研究發(fā)現(xiàn)激活Rho激酶通路

8、,使Beclin-1 BH3結(jié)構(gòu)域發(fā)生磷酸化,導(dǎo)致Beclin-1-Bcl-2多聚蛋白復(fù)合體解離,而不影響UVRAG-Beclin-1復(fù)合體的相互作用和增加Beclin-1和Vps34的相互作用,從而引起自噬發(fā)生;Yunbo chen等研究發(fā)現(xiàn)Aβ活化物能上調(diào)ROCK表達而激活自噬。3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)是磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)的特殊抑制

9、劑,通過抑制Beclin-1-PI3KC3復(fù)合物的形成,而抑制自噬活性。目前研究顯示 Rho激酶途徑活化與 PI3K/AKT通路的活化相關(guān)。結(jié)合 ROCKs抑制劑法舒地爾對慢性腎臟病的保護作用。本研究擬采用AngII體外刺激足細胞,觀察足細胞的自噬情況,并通過法舒地爾和3-MA干預(yù)此過程,初步探討Ang II誘導(dǎo)足細胞自噬的可能機制,為腎臟疾病的治療的提供新思路。
　　實驗方法:
　　1.人永生化足細胞(AB8/13)的復(fù)蘇

10、及培養(yǎng),在33℃、5％CO2中增值,在37℃、5%CO2中分化成熟后實驗。
　　2.體外采用不同濃度AngII(10-8~10-6mol/l)刺激足細胞24h及固定濃度刺激足細胞不同時間(0h、6h、12h、24h、36h)后,Western blot檢測足細胞LC3-II和Beclin-1蛋白的表達情況。
　　3.將足細胞(AB8/13)進行細胞爬片,用PI3K抑制劑3-MA(5mM)和Rho激酶抑制劑法舒地爾(10-7m

11、ol/l)預(yù)處理30min,AngII刺激足細胞24h后以免疫熒光法檢測自噬標志物L(fēng)C3的表達及分布情況。
　　4.不同法舒地爾濃度(10-8~10-6mol/l)預(yù)處理足細胞30min,AngII刺激足細胞24h后,Western blot檢測足細胞LC3-II和Beclin-1蛋白的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.不同濃度(10-8mol/l~10-6mol/l)AngII刺激足細胞24h后,Western blo

12、t檢測LC3-II的蛋白表達,隨著劑量的增加,LC3-II的蛋白表達增加,在濃度為10-7mol/l時達到峰值。
　　2.固定濃度(10-7mol/l)AngII刺激足細胞不同時間(0h、6h、12h、24h、36h),Western blot檢測LC3-II的蛋白表達,隨著時間的延長,LC3-II的蛋白表達增加,在24h達到峰值,后呈下降趨勢。
　　3.不同濃度(10-8mol/l~10-6mol/l)AngII刺激足細胞

13、24h后, Western blot檢測Beclin-1的蛋白表達,隨著劑量的增加,Beclin-1的蛋白表達增加,在濃度為10-7mol/l時達到峰值。
　　4.固定濃度(10-7mol/l)AngII刺激足細胞不同時間(0h、6h、12h、24h、36h),Western blot檢測 Beclin-1的蛋白表達,隨著時間的延長,Beclin-1的蛋白表達增加,在24h達到峰值,后呈下降趨勢。
　　5.3-MA抑制Ang

14、II誘導(dǎo)的足細胞LC3的表達,并抑制其向細胞核周圍聚集。
　　6.法舒地爾單獨不影響足細胞 LC3-II和 Beclin-1的蛋白表達,但能降低 AngII引起的 LC3-II和 Beclin-1的表達,并呈一定的濃度依賴,法舒地爾濃度為10-7mol/l時抑制作用最強。
　　7.免疫熒光檢測單獨法舒地爾不影響LC3的表達,但能抑制AngII誘導(dǎo)的足細胞LC3的表達及向細胞核周圍聚集。
　　結(jié)論:
　　本實驗發(fā)現(xiàn)