血管緊張素Ⅱ對滋養(yǎng)細胞侵襲力影響的研究.pdf

1、背景與目的: 子癇前期(preeclampsia)是妊娠期特有的疾病，是孕產婦和圍生兒死亡的主要原因之一。目前病因不明，給該病的防治工作帶來困難。研究表明血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)及其1型受體(Angiotensinreceptor1subtype，AT1R)的異常表達，在子癇前期(pre-eclampsia)發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[1]。母兒界面AngⅡ水平升高或與其受體結合增強，影響了正常胎盤的形成

2、和螺旋動脈的重鑄，參與子癇前期的發(fā)生、發(fā)展。纈沙坦是AT1R高度特異拮抗劑，能阻斷AngⅡ和AT1R結合，具有高效的抗高血壓作用，其能否用于子癇前期的防治未見報道。 滋養(yǎng)細胞侵襲力下降是子癇前期發(fā)生、發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)[2]。有研究[3]發(fā)現100nMAngⅡ作用滋養(yǎng)細胞系HTR-8/Svneo24小時能顯著抑制滋養(yǎng)細胞的侵襲力，但諸多的實驗發(fā)現AngⅡ通過激活細胞內局灶粘附激酶(focaladhesionkinase,FAK)酪氨

3、酸磷酸化，促進多種細胞如血管平滑肌、內皮細胞等增殖、遷移/侵襲[4，5]。FAK是介導細胞侵襲/遷移的信號轉導通路的重要激酶之一，其中FAK的酪氨酸397位點(tyr397)是細胞遷移的關鍵部位[6]，在子癇前期細胞滋養(yǎng)細胞(cytotrophoblast,CTB)中FAK(tyr397)低表達[7]。AngⅡ能否通過FAK信號通路調節(jié)滋養(yǎng)細胞生物學活性尚未見研究報道。 我們利用寒冷刺激子癇前期孕鼠模型[8]，研究纈沙坦對子癇前

4、期的防治作用，以及信號轉導分子FAK(tyr397)在子癇前期及纈沙坦治療孕鼠胎盤組織中的表達；體外培養(yǎng)滋養(yǎng)細胞，研究AngⅡ及其受體AT1對滋養(yǎng)細胞侵襲力的影響及FAK信號轉導對AngⅡ在滋養(yǎng)細胞侵襲力中的作用。有望通過本實驗能對子癇前期的發(fā)病機制的研究及防治提供一定的幫助。 方法: 第一部分：血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑纈沙坦對寒冷刺激子癇前期孕鼠防治作用。建立實驗動物模型，實驗分三組：正常妊娠組(N組)；寒冷刺激誘發(fā)子癇

5、前期組(H組)；纈沙坦干預治療組(V組)。V組孕鼠纈沙坦水溶液灌胃(10mg/kg·d)，N和H組孕鼠蒸餾水灌胃，定期測鼠尾動脈收縮壓及15h尿蛋白。于妊娠第19天剖腹取胎，計數胎鼠存活率及體重，留取腎、胎盤組織，HE染色觀察組織形態(tài)病理學變化，免疫組化法檢測胎盤組織中FAK(tyr397)的表達。 第二部分：血管緊張素Ⅱ對滋養(yǎng)細胞侵襲力的影響及機制初步研究。采用組織貼塊法、Ficoll分離及差速貼壁法對早孕絨毛純化培養(yǎng)，細胞角

6、蛋白7(Cytokeratin7,CK-7)及vimentin免疫鑒定。不同濃度AngⅡ及纈沙坦處理滋養(yǎng)細胞，用被覆Matrigel膜的體外侵襲模型transwell分析AngⅡ及其受體AT1影響滋養(yǎng)細胞侵襲力的量效及時效關系。并用Westernblot檢測細胞內FAK(tyr397)磷酸化水平。 結果: 第一部分：妊娠第6天以后V組的血壓顯著低于H組(P＜0.01)，第12后發(fā)現V組的血壓同時顯著低于N組(P＜0.05

7、)。妊娠第18天時V組的尿蛋白顯著低于H組(P＜0.05)。三組胎鼠的體重及胎盤重量無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。V組胎鼠存活率只有85.53％，明顯低于N組(100％)和H組(98.18％)。V組胎盤滋養(yǎng)細胞FAK(tyr397)蛋白陽性表達強度顯著高于H組(P＜0.01)，胎盤、腎組織的異常病理狀況有明顯改善。 第二部分：不同濃度AngⅡ作用24h，當AngⅡ濃度為10-6M時，遷移的細胞數最多，較對照組顯著升高(P＜0

8、.01)。之后隨濃度升高，細胞侵襲力下降，當濃度達到10-5M時，遷移的細胞數顯著降低(P＜0.05)。10-5MAngⅡ作用不同時間點后發(fā)現12h時細胞侵襲能力最強，顯著高于對照組(P＜0.01)，之后迅速下降，24h、48h及72h細胞侵襲能力均顯著低于對照組(P＜0.05)，而對照組細胞侵襲力先升高，到48h時侵襲力最強，之后降低。用纈沙坦預處理30min再用10-5MAngⅡ作用24h，細胞侵襲力較10-5MAngⅡ組升高(P＞

9、0.05)。不同濃度AngⅡ作用10min后測FAK(tyr397)磷酸化水平，隨AngⅡ濃度增加FAK(tyr397)水平升高，當AngⅡ濃度為10-7M時，較對照組有顯著性升高(P＜0.01)，當濃度為10-5M時FAK(tyr397)表達最高。10-5MAngⅡ作用不同時間點測FAK(tyr397)磷酸化水平，發(fā)現5min時顯著升高(P＜0.01)，10min時達高峰，之后逐漸下降，但20min、30min時FAK(tyr397)

10、磷酸化水平均顯著高于對照組(P＜0.01)，60min時與對照組無顯著性統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。10-7M纈沙坦+10-5MAngⅡ共同處理細胞后，FAK活性較10-5MAngⅡ組明顯降低(P＜0.01)，較10-7M纈沙坦處理組顯著性升高(P＜0.01)。 結論： 1.纈沙坦用于子癇前期孕鼠，能明顯改善子癇前期的臨床癥狀及病理改變，使子癇前期孕鼠血壓下降、蛋白尿減輕，腎、胎盤組織的病理改變減輕。 2.纈沙坦

11、干預治療后能明顯提高胎盤滋養(yǎng)細胞FAK(tyr397)的表達，提示纈沙坦可能通過增強子癇前期孕鼠滋養(yǎng)細胞侵襲力從而控制子癇前期發(fā)生。 3.滋養(yǎng)細胞侵襲力與AngⅡ濃度及作用時間有關。AngⅡ短時間作用能增強細胞侵襲力；AngⅡ高濃度、長時間作用時能抑制細胞侵襲力，纈沙坦能阻斷AngⅡ對滋養(yǎng)細胞侵襲力的影響。推測體內過度升高的AngⅡ長時間作用，能通過抑制滋養(yǎng)細胞侵襲力導致子癇前期的發(fā)生。 4.AngⅡ通過與受體AT1結合