血管緊張素-（1-7）對血管緊張素Ⅱ誘導大鼠系膜細胞增殖與細胞外基質(zhì)分泌的影響.pdf

1、目的：探討血管緊張素-(1-7)[Ang-(1-7)]對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導大鼠系膜細胞(GMC)增殖與細胞外基質(zhì)分泌的影響，并初步了解Ang-(1-7)的作用受體。 方法：將生長在96孔培養(yǎng)板上無血清靜止培養(yǎng)24h的大鼠GMC培養(yǎng)液，按以下分組加入不同干擾因素進行實驗。①對照組：GMC培養(yǎng)液中不加干擾因素；②AngⅡ組：加入AngⅡ10-7mol/L；③Ang-(1-7)組：加入Ang-(1-7)10-6mol/L；④

2、Ang-(1-7)+AngⅡ組：在加入AngⅡ10-7mol/L的基礎上，分別加入Ang-(1-7)10-6mol/L；Ang-(1-7)10-7mol/L；Ang-(1-7)10-8mol/L；Ang-(1-7)10-9mol/L；⑤AngⅡ受體1(AT1受體)拮抗劑[Sar1，Ile8]-AngⅡ+Ang-(1-7)組：先用[Sar1，Ile8]-AngⅡ(10-6mol/L)預處理30分鐘后，再加入Ang-(1-7)10-6mol

3、/L；⑥血管緊張素Ⅱ受體2(AT2受體)拮抗劑PD123319+Ang-(1-7)組：先用PD123319(10-5mol/L)預處理30分鐘后，再加入Ang-(1-7)10-6mol/L。每組設6個復管，放入培養(yǎng)箱中孵育48小時。通過3[H]-Thymidine及3[H]-Leucine摻入分別測定GMC的DNA、蛋白質(zhì)合成：按上述分組加入不同干預藥物的同時，在96孔板加入37kBq3[H]thymidine共同培養(yǎng)24h，移去培養(yǎng)液

4、并用預冷的100g/L三氯乙酸于4C固定30min，然后用平衡鹽溶液洗2次，最后用10g/LSDS0.1mol/LNaOH溶液0.1mL裂解細胞，37C放置過夜，收集細胞裂解液至有閃爍液的測量杯中，搖勻放置待其溶解后于FJ-2107P液體閃爍儀測定放射性核數(shù)計數(shù)率(cpm/Well)。用3[H]Leucine代替3[H]thymidine，進行蛋白質(zhì)合成的測定；用結(jié)晶紫染色的方法檢測細胞數(shù)目：按上述分組加入不同干預藥物，在96孔板培養(yǎng)4

5、8h，加0.1ml5％(50g/L)的戊二醛液固定細胞15min，0.1ml去離子水沖洗3遍，用新配制的1g/L的結(jié)晶紫染色20min，用0.1ml去離子水沖洗3遍，每個培養(yǎng)孔內(nèi)加入0.1mlTritonX-100以提取被細胞核吸收的結(jié)晶紫液，用分光光度計在630nm處測量每個培養(yǎng)孔的吸光(A)值；放免法檢測細胞培養(yǎng)上清液中Ⅲ型前膠原(PcⅢ)和透明質(zhì)酸(HA)的含量：按上述分組加入不同干預藥物后48小時，吸取培養(yǎng)上清液至2ml小試管中

6、，立即用放免法分別檢測PcⅢ及HA的含量，均按試劑盒說明書進行。實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差(X±S)表示，各組均數(shù)用單因素方差分析及兩兩均數(shù)q檢驗作統(tǒng)計學處理，組間差異均以p＜0.05為有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果：AngⅡ誘導大鼠GMCDNA和蛋白質(zhì)合成，Ang-(1-7)則明顯抑制系膜細胞DNA和蛋白質(zhì)合成增加；濃度為10-9mol/L至10-6mol/L的Ang-(1-7)抑制AngⅡ誘導大鼠GMC的DNA和蛋白質(zhì)合成作用逐漸增強，用

7、[Sar1，Ile8]-AngⅡ和PD123319分別預處理30min后加Ang-(1-7)，對Ang-(1-7)抑制大鼠GMC的DNA和蛋白質(zhì)合成作用無顯增影響，與單獨Ang-(1-7)組比較，差別無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)；AngⅡ可誘導GMC增殖(P＜0.05)，Ang-(1-7)10-6mol/L抑制GMC增殖(P＜0.05)，且Ang-(1-7)呈劑量依賴性地抑制AngⅡ的促系膜細胞增殖作用。[Sar1，Ile8]-AngⅡ

8、與PD123319分別預處理30min后加Ang-(1-7)，對Ang-(1-7)抑制大鼠GMC的增殖作用無顯著影響，與單獨Ang-(1-7)組比較，差別無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)；用放免法檢測各組處理48小時后細胞上清液中透明質(zhì)酸(HA)及Ⅲ型前膠原(PcⅢ)的含量：AngⅡ誘導GMC分泌HA及PcⅢ，Ang-(1-7)10-6mol/L抑制GMCHA及PcⅢH的分泌(P＜0.05)，且Ang-(1-7)對AngⅡ誘導GMCHA及P

9、cⅢ分泌的抑制呈劑量依賴性增強。[Sar1，Ile8]-AngⅡ與PD123319分別預處理30min后加Ang-(1-7)，對Ang-(1-7)抑制大鼠GMCHA及PcⅢ的分泌增加無顯著影響，與單獨Ang-(1-7)組比較，差別無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。 結(jié)論：①AngⅡ誘導GMCDNA、蛋白質(zhì)合成及細胞數(shù)目增加與細胞外基質(zhì)PcⅢ、HA的分泌；②Ang-(1-7)抑制GMCDNA、蛋白質(zhì)合成及細胞數(shù)目增加與細胞外基質(zhì)PcⅢ