Wnt信號傳導(dǎo)通路對滋養(yǎng)細(xì)胞GCM-1-HtrA4的表達(dá)及細(xì)胞侵襲力的影響.pdf

1、胎盤是妊娠期間母胎物質(zhì)交換的重要器官，胎兒依靠胎盤從母體獲取營養(yǎng)和氣體，胎盤還可以合成多種激素、酶和細(xì)胞因子等維持正常妊娠。胎盤由羊膜、葉狀絨毛膜和底蛻膜三部分構(gòu)成，其中葉狀絨毛膜占胎盤組織的主要部分，它是由囊胚的滋養(yǎng)層發(fā)育而來。滋養(yǎng)細(xì)胞是構(gòu)成絨毛膜的主要成分，隨著妊娠的發(fā)展可分化為多種滋養(yǎng)細(xì)胞，如細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、合體滋養(yǎng)細(xì)胞和絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(EVTs)。細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞和合體滋養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞，他們分別形成絨毛的內(nèi)層和外層，構(gòu)成人類

2、胎盤的基本運(yùn)輸單位，為胎兒運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)。合體滋養(yǎng)細(xì)胞還分泌大量的激素，如人絨毛膜促性腺激素，對維持正常妊娠是必不可少的。絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞在胎盤的發(fā)育過程中可侵犯胎盤床的螺旋動(dòng)脈，引起螺旋動(dòng)脈重塑，維持胎盤的正常生理功能。大量研究表明，絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲異?？梢鹇菪齽?dòng)脈重塑失敗及胎盤淺著床，導(dǎo)致多種妊娠疾病的發(fā)生，如子癇前期和嚴(yán)重宮內(nèi)胎兒生長受限等。
　　Wnt信號傳導(dǎo)通路是參與胎盤發(fā)育過程的保守通路之一。經(jīng)典 Wnt信號傳導(dǎo)通路即

3、Wnt/β-catenin，該通路的活化依賴胞外Wnt蛋白配體與其受體結(jié)合后，抑制胞內(nèi)APC/Axin/GSK-3β/CK1α降解復(fù)合體形成，阻斷β-catenin的降解途徑，使β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)累積，繼而轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合并將TCF/LEF活化為轉(zhuǎn)錄激活蛋白?；罨蟮腖EF-1/TCF可以調(diào)節(jié)多種靶蛋白的表達(dá)，繼而發(fā)揮一系列生理功能。研究表明，Wnt信號傳導(dǎo)通路可參與調(diào)控人類滋養(yǎng)細(xì)胞的多種生理過程，如

4、滋養(yǎng)細(xì)胞的黏附，侵襲和分化。DKK1是一種分泌型糖蛋白，它與Wnt受體LRP5/6及另一類穿膜蛋白結(jié)合形成三聚體，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞，減少細(xì)胞膜上LRP5/6的表達(dá)，從而阻斷經(jīng)典Wnt信號向胞內(nèi)的傳導(dǎo)，影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲、遷移等。
　　目前，Yao-Yu Chen等研究發(fā)現(xiàn) HtrAa家族可參與細(xì)胞侵襲的調(diào)控，HtrA4是一種絲氨酸蛋白酶，它可以降解纖維連接蛋白，促進(jìn)細(xì)胞的侵襲。Liang-Jie Wang等采用染色質(zhì)免疫沉淀芯片分析技術(shù)

5、證實(shí)HtrA4基因是GCM1的靶基因。GCM1是胎盤形成過程中的一個(gè)重要轉(zhuǎn)化因子，研究發(fā)現(xiàn)它可以通過調(diào)節(jié)胎盤生長因子（PGF）及合胞素的表達(dá)，促進(jìn)胎盤血管的生成以及滋養(yǎng)細(xì)胞的融合，且Lu J等研究者發(fā)現(xiàn)GCM-1和Wnt信號傳導(dǎo)通路成員Fzd5之間可能存在正反饋?zhàn)饔?，共同調(diào)節(jié)絨毛分支的形成。然而，經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)通路是否通過調(diào)節(jié)GCM-1/HtrA4的表達(dá)進(jìn)而影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力目前尚未報(bào)道。本研究利用Wnt信號傳導(dǎo)通路阻滯劑Dickk

6、opf-1(DKK-1)處理人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞系JEG－3細(xì)胞和JAR細(xì)胞，探討 Wnt信號傳導(dǎo)通路對滋養(yǎng)細(xì)胞中 GCM-1/HtrA4的表達(dá)及細(xì)胞侵襲力的影響。
　　目的:研究采用熒光定量PCR、蛋白免疫印跡和Transwell實(shí)驗(yàn)，分別檢測人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞系JEG-3細(xì)胞和JAR細(xì)胞在DKK-1處理前后β-catenin、GCM-1、HtrA4 mRNA和蛋白的表達(dá)以及細(xì)胞侵襲力的改變。探討Wnt信號傳導(dǎo)通路對滋養(yǎng)細(xì)胞GCM-1

7、/HtrA4的表達(dá)及細(xì)胞侵襲力的影響。
　　材料和方法:
　　1.研究對象:本研究選用人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞系 JEG－3細(xì)胞和JAR細(xì)胞（購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司），在37℃、5％ CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中，用含10%FBS、100U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM-H完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
　　2.方法:本研究利用DMEM-H完全培養(yǎng)基(10%FBS、100

8、U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素)將細(xì)胞懸浮，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞的生長曲線，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時(shí)，將其消化并接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞濃度為1.5×106，接種完畢，將細(xì)胞培養(yǎng)板放入恒溫培養(yǎng)箱孵育24 h。然后，將不同凍存批次的細(xì)胞分別進(jìn)行配對分組：對照組和DKK-1(150ng/ml)處理組。將各組細(xì)胞放入恒溫培養(yǎng)箱24h后，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并進(jìn)行后續(xù)檢測。采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞處

9、理前后侵襲力的變化。同時(shí)提取各組細(xì)胞的mRNA和蛋白，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)(Real time-PCR)和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot)分別檢測處理前后細(xì)胞中β-catenin、GCM-1、HtrA4 mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:本研究采用SPSS17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，數(shù)據(jù)均以?x±s的方式表示。當(dāng)數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布時(shí)采用配對設(shè)計(jì)定量資料的t檢驗(yàn)，當(dāng)數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布時(shí)采用配

10、對設(shè)計(jì)定量資料的符號秩和檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果:
　　1.Wnt信號通路阻滯劑 DKK1處理后滋養(yǎng)細(xì)胞β-catenin、GCM1和HtrA4 mRNA的表達(dá)
　　1.1 Wnt信號通路阻滯劑DKK1處理后滋養(yǎng)細(xì)胞β-catenin mRNA的表達(dá):DKK1處理24h后，實(shí)驗(yàn)組JEG-3細(xì)胞中β-catenin mRNA的表達(dá)水平(0.45±0.15)，與對照組(1.00±0.24)相比明顯降低，經(jīng)

11、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；實(shí)驗(yàn)組JAR細(xì)胞中β-catenin mRNA的表達(dá)水平(0.52±0.18)，與對照組(1.00±0.39)相比明顯降低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　1.2 Wnt信號通路阻滯劑DKK1處理后滋養(yǎng)細(xì)胞GCM1 mRNA的表達(dá):DKK1處理24h后，實(shí)驗(yàn)組JEG-3細(xì)胞中GCM1 mRNA的表達(dá)水平(0.66±0.22)，與對照組(1.00±0.31)相比明顯降低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異具有

12、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組JAR細(xì)胞中GCM1 mRNA的表達(dá)水平(0.74±0.25)，與對照組(1.00±0.30)相比明顯降低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　1.3 Wnt信號通路阻滯劑DKK1處理后滋養(yǎng)細(xì)胞HtrA4 mRNA的表達(dá):DKK1處理24h后，實(shí)驗(yàn)組JEG-3細(xì)胞中HtrA4 mRNA的表達(dá)水平(0.45±0.29)，與對照組(0.99±0.50)相比明顯降低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

13、(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組JAR細(xì)胞中HtrA4 mRNA的表達(dá)水平(0.46±0.17)，與對照組(1.00±0.50)相比明顯降低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2 Wnt信號通路阻滯劑 DKK1處理后滋養(yǎng)細(xì)胞β-catenin、GCM1和HtrA4蛋白的表達(dá)
　　2.1 Wnt信號通路阻滯劑DKK1處理后滋養(yǎng)細(xì)胞β-catenin蛋白的表達(dá):DKK1處理24h后，實(shí)驗(yàn)組JEG-3細(xì)胞中β-catenin蛋白的相

14、對表達(dá)量(0.48±0.14)，與對照組(0.89±0.14)相比明顯降低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；實(shí)驗(yàn)組JAR細(xì)胞中β-catenin蛋白的相對表達(dá)量(0.65±0.11)，與對照組(0.84±0.06)相比明顯降低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.2 Wnt信號通路阻滯劑DKK1處理后滋養(yǎng)細(xì)胞GCM1蛋白的表達(dá):DKK1處理24h后，實(shí)驗(yàn)組JEG-3細(xì)胞中GCM1蛋白的相對表達(dá)量(0.60±0.19)，與

15、對照組(0.78±0.16)相比明顯降低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；實(shí)驗(yàn)組JAR細(xì)胞中GCM1蛋白的相對表達(dá)量(0.68±0.07)，與對照組(0.79±0.14)相比明顯降低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.3 Wnt信號通路阻滯劑DKK1處理后滋養(yǎng)細(xì)胞HtrA4蛋白的表達(dá):DKK1處理24h后，實(shí)驗(yàn)組JEG-3細(xì)胞中HtrA4蛋白的相對表達(dá)量(0.07±0.16)，與對照組(0.15±0.08)相比明顯降低

16、，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；實(shí)驗(yàn)組JAR細(xì)胞中HtrA4蛋白的相對表達(dá)量(0.06±0.02)，與對照組(0.17±0.02)相比明顯降低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3. Wnt信號通路阻滯劑DKK1處理后滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力的改變:經(jīng)DKK-1干預(yù)36h后，實(shí)驗(yàn)組JEG-3細(xì)胞發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)(79.38±13.15)，與對照組(102.40±17.35)相比明顯降低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；實(shí)驗(yàn)組JA