shRNA干擾MACC1表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移、侵襲力的影響及其相關(guān)上游信號通路研究.pdf

1、目的：探討RNA干擾抑制MACC1基因表達(dá)對結(jié)腸癌SW620細(xì)胞遷移、侵襲的調(diào)控作用，初步探討調(diào)控過程中可能涉及的上游信號通路。
　　方法：（1）根據(jù)MACC1基因（7p21.1）核苷酸序列(NM_182762.3)設(shè)計(jì)并構(gòu)建3個含不同RNA干擾片段的MACC1-shRNA＃1~3重組質(zhì)粒，利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)，轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞株中，經(jīng)嘌呤霉素篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SW620細(xì)胞株，同法獲

2、得陰性對照組細(xì)胞。（2）將獲得的細(xì)胞株采用qPCR、Western Blot進(jìn)行干擾效能檢測并篩選出干擾效果最佳的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SW620細(xì)胞株。（3）設(shè)立實(shí)驗(yàn)組（MACC1-RNAi＃2/SW620細(xì)胞株）、陰性對照組（MACC1-control/SW620細(xì)胞株）和空白對照組（未處理的SW620細(xì)胞株），采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)觀察RNA干擾后細(xì)胞的遷移、侵襲能力的變化。（4）應(yīng)用蛋白激酶特異性抑制劑PD9805

3、9、Curcumin、Wortmannin、Dasatinib處理以上實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組和空白對照組三組SW620細(xì)胞株，阻斷可能影響結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲力的分子通路：Ras/Raf/MAPK、Wnt/β-Catenin/GSK-3β、PI3K/ILK/PKB、Src/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過qPCR檢測上述三組SW620細(xì)胞中MACC1基因mRNA表達(dá)，篩選出MACC1基因在結(jié)腸癌SW620細(xì)胞遷移、侵襲力調(diào)控中所涉及的可能上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

4、通路。
　　結(jié)果：成功獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SW620細(xì)胞，通過嘌呤霉素篩選的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率達(dá)80％以上。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞株干擾效能檢測結(jié)果顯示：與陰性對照組及空白對照組相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SW620細(xì)胞株的MACC1基因mRNA及蛋白的表達(dá)降低，（P＜0.05）。干擾組之兩兩比較顯示：MACC1-RNAi＃2/SW620細(xì)胞株干擾效果最明顯（P＜0.05）。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與對照組對比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞（MACC1-RNAi＃2/SW62

5、0細(xì)胞株）的遷移能力降低，（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞（MACC1-RNAi＃2/SW620細(xì)胞株）的侵襲能力受到了顯著抑制，（P＜0.05）。激酶特異性抑制劑處理的細(xì)胞qPCR檢測結(jié)果顯示：抑制劑抑制Ras/Raf/MAPK、Wnt/β-Catenin/GSK-3β及Src/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后，SW620細(xì)胞株中MACC1基因mRNA表達(dá)下降，（P＜0.05）。抑制PI