JAK2-STAT3通路對結腸癌LoVo細胞侵襲遷移的影響及機制研究.pdf

1、背景及目的:
　　 結腸癌是常見的惡性腫瘤,發(fā)病率逐年上升,且預后較差,約有90％的病人死于腫瘤的遠處轉移或復發(fā)。目前認為腫瘤侵襲轉移的過程包括:腫瘤細胞從原發(fā)灶脫離,穿過基底膜細胞外基質(zhì),遷移到周圍血管和淋巴管,到達遠處器官后與內(nèi)皮細胞粘附,侵出血管外定植,形成轉移灶。在上述過程中,許多細胞因子在不同階段發(fā)揮重要作用,影響腫瘤細胞的侵襲轉移。大量研究證實表皮生長因子/受體(EGF/EGFR)與結腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關,是近年研

2、究的熱點。EGFR屬于跨膜受體酪氨酸蛋白激酶,活化的EGFR可激活細胞內(nèi)多條信號通路,包括Ras/Raf/MAPK,PI3K/Akt,JAK/STAT等。其中JAK2-STAT3(Janus kinase2-signal transducer and activator of transcription3)是近來頗受關注的一條信號傳導通路。JAK2結合到相應的膜受體上,使受體的酪氨酸活化,暴露結合STAT3位點,然后JAK2磷酸化STA

3、T3的酪氨酸。磷酸化STAT3(P-STAT3)形成二聚體進入細胞核內(nèi),與靶基因結合,調(diào)節(jié)細胞增殖、抗凋亡、腫瘤血管生成和免疫逃疫等功能。研究發(fā)現(xiàn)STAT3還能調(diào)控細胞中E-鈣粘蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表達,而這兩種蛋白與腫瘤細胞間的粘附和腫瘤細胞的運動功能有關。STAT3的異常表達和活化在乳腺癌、前列腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn),能明顯促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。鑒于以上研究,我們推測表皮生長因子可能通

4、過激活JAK2-STAT3通路調(diào)節(jié)E-cadherin和Vimentin表達,從而促進結腸癌細胞的侵襲遷移。為此,本研究先在結腸癌組織中檢測STAT3、E-cadherin和Vimentin表達,探討其與結腸癌臨床病理的關系。然后用EGF和JAK2激酶抑制劑AG490分組處理結腸癌LoVo細胞,研究JAK2/STAT3通路對結腸癌LoVo細胞E-cadherin和Vimentin表達及侵襲遷移能力的影響。探討JAK2/STAT3通路在結

5、腸癌LoVo細胞侵襲遷移中的作用及機制,為防治結腸癌侵襲轉移提供客觀的實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.收集70例結腸癌患者的癌組織和癌旁正常結組織標本,應用免疫組織化學方法檢測STAT3、E-cadherin、Vimentin蛋白表達,系統(tǒng)分析并比較三種蛋白表達與漿膜受侵、淋巴結轉移、臨床病理分期(TNM)、病理分化類型等臨床病理因素的關系;
　　 2.特異性的JAK2激酶抑制劑AG490設10、25、50、

6、100、150μmol/L濃度組,分別處理結腸癌LoVo細胞6、12、24、72、48小時,MTT檢測細胞增殖。將結腸癌LoVo細胞分對照組、EGF組、EGF+AG490組、AG490組,流式細胞儀檢測LoVo細胞的細胞周期,Western blot檢測LoVo細胞中磷酸化STAT3蛋白表達;
　　 3.應用細胞劃痕試驗和Transwell小室檢測結腸癌LoVo細胞對照組、EGF組、EGF+AG490組、AG490組的細胞遷移和

7、侵襲能力,免疫熒光和Western blot檢測E-cadherin、Vimentin在各組結腸癌細胞中的定位及表達。
　　 結果:
　　 1.免疫組織化學檢測STAT3、E-cadherin、Vimentin在結腸癌組織中陽性表達率分別為74.29％,32.86％,78.57％,在癌旁正常組織中為15.71％,82.86％,12.86％。三種蛋白表達水平與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期相關(P＜0.05

8、),而與年齡、性別、腫瘤的大小、部位無關(P＞0.05)。結腸癌組織中STAT3與Vimentin表達呈現(xiàn)正相關(r=0.616,P＜0.01),與E-cadherin表達呈負相關(r=-0.702,P＜0.01)。
　　 2.AG490抑制結腸癌LoVo細胞增殖作用呈現(xiàn)濃度時間依賴性,最佳作用濃度、時間為50μmol/L、24小時。與對照組比較,EGF組P-STAT3表達量明顯上調(diào),細胞增殖指數(shù)(63.17％±4.25)亦明顯

9、增加(P＜0.01);EGF+AG490組和AG490組P-STAT3表達量明顯下調(diào)(P＜0.05),細胞增殖指數(shù)(分別為27.91％±3.16、23.85％±1.07)明顯降低(P＜0.01)。
　　 3.①細胞劃痕:結腸癌LoVo細胞對照組、EGF組、EGF+AG490組、AG490組細胞劃痕愈合面積分別為38％、80％、40％、24％。與對照組比較,EGF組愈合面積明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);EGF+AG4

10、90組和AG490組面積減少,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);
　　 ②Transwell:結腸癌LoVo細胞對照組、EGF組、EGF+AG490組、AG490組LoVo細胞侵襲細胞數(shù)分別為35.24±2.65、55.08±2.14、20.19±3.50、16.52±2.02。與對照組比較,EGF組侵襲細胞數(shù)明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),EGF+AG490組和AG490組侵襲細胞數(shù)明顯減少(P＜0.05)。

11、>　　 ③Westernblot:與對照組相比,EGF組中E-cadherin表達顯著降低,同時Vimentin表達顯著增加,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),免疫熒光顯示E-cadherin向胞漿移位,Vimentin在LoVo細胞胞漿內(nèi)表達;EGF+AG490組和AG490組中E-cadherin表達顯著增加,而Vimentin表達減少,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1.STAT3和Vim