基于JAK2-STAT3通路的氧化苦參堿抗胰腺纖維化機制研究.pdf

1、目的：探究Janus激酶2（janus kinase2, JAK2）/信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)激酶3（signal transducer and activator of transcription3, STAT3）信號通路對大鼠胰腺星狀細胞（pancreatic stellate cells, PSC）激活的影響，為氧化苦參堿（oxymatrine, OM）抗慢性胰腺炎（chronic pancreatitis, CP）胰腺纖維化提供理論依

2、據(jù)。
　　方法：本實驗分以下兩部分：細胞實驗研究JAK2/STAT3信號通路是否參與轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）激活 PSC；動物實驗檢測OM抗胰腺纖維化中對胰腺組織內(nèi)JAK2/STAT3信號通路影響。在細胞實驗部分，使用不同濃度梯度（0、4、8、12、16和20 ng/ml）和時間梯度（6、12、18和24 h）的 TGF-β1刺激永生化大鼠胰腺星狀細胞（panc

3、reatic stellate cells, PSC）LTC-14細胞，應用MTT檢測法獲得LTC-14細胞活性最高時的最適濃度和最適時間。隨后在 TGF-β1最適濃度和時間刺激下，利用 Western Blot和Realtime PCR檢測LTC-14細胞中α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）和JAK2/STAT3信號通路分子表達。通過給予 LTC-14細胞 JAK2特異性拮抗劑AG490，觀察

4、JAK2通路阻斷后對該細胞激活的影響，并利用ELISA檢測JAK2對TGF-β1誘導LTC-14細胞分泌IL-6和IL-1β的影響。制備STAT3不同位點的干擾質(zhì)粒，通過Western Blot和Realtime PCR獲得STAT3干擾RNA的有效位點。再通過轉(zhuǎn)染有效的STAT3干擾質(zhì)粒，檢測STAT3表達抑制對LTC-14細胞激活的影響。在動物實驗部分，雄性Wistar大鼠（體重250-300 g）32只，按體重編號后，隨機將大鼠分

5、為正常對照組（NC組）、模型組（CP組）、OM預防組（OP組）和OM陰性對照組（OM組），每組8只。CP組和OP組大鼠按照500mg/kg/2d的量腹腔注射二乙基二硫代氨基甲酸鈉（Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate, DDC）來建立大鼠CP胰腺纖維化模型，NC組和OM組注射等體積的生理鹽水。在注射DDC前2 h，OP組按照100 mg/kg/d的量腹腔注射OM對大鼠進行治療， OM組注射等體

6、積OM做陰性對照，其余兩組注射等體積的生理鹽水。注射實驗進行4周，利用Masson染色檢測胰腺組織纖維化程度；Realtime PCR檢測胰腺組織中JAK2、STAT3和SOCS3的表達。所有實驗進行三次獨立重復，使用Graphpad Prism6.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，兩組樣本采用t檢驗，多組樣本采用單因素方差分析，P﹤0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：在細胞實驗部分，MTT法檢測結(jié)果顯示TGF-β1刺激最適濃度為8 ng/

7、ml，最適時間為12 h。使用8 ng/ml TGF-β1刺激LTC-14細胞12 h后，我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1刺激組細胞內(nèi) JAK2、STAT3、SOCS3、p-STAT3和α-SMA蛋白表達均較對照組明顯升高（P﹤0.05）；Realtime-PCR結(jié)果顯示 TGF-β1刺激組細胞內(nèi)誘導的JAK2、STAT3、SOCS3和α-SMA分子的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于對照組（P﹤0.05）。給予LTC-14細胞AG490，可明顯抑制TGF-β1誘導

8、的STAT3的激活以及SOCS3、α-SMA的mRNA與蛋白生成（P﹤0.05）。ELISA檢測結(jié)果顯示TGF-β1可明顯誘導LTC-14細胞外IL-6和IL-1β的分泌（P﹤0.05），而使用AG490能夠明顯抑制TGF-β1誘導細胞外 IL-6和IL-1β的分泌（P﹤0.05）。針對STAT3多個位點設計干擾 RNA，發(fā)現(xiàn) STAT3基因1345位點干擾 RNA可成功抑制 STAT3蛋白和mRNA的生成（P﹤0.05）。使用該 ST

9、AT3干擾 RNA能夠明顯減少LTC-14細胞中TGF-β1誘導的STAT3、SOCS3和α-SMA蛋白與mRNA的生成（P﹤0.05），并且減少STAT3的激活（P﹤0.05）。在動物實驗部分，Masson染色見CP組胰腺纖維化程度明顯高于 NC組（P﹤0.05）；與 CP相比，OP組膠原纖維面積百分比明顯減少（P﹤0.05）；而 OP組、NC組和OM組之間無明顯差異（P﹥0.05）。Realtime PCR結(jié)果顯示CP組大鼠胰腺組織

10、中JAK2，STAT3和SOCS3 mRNA表達量明顯均高于 NC組和OM組（P﹤0.05）；與 CP組相比，OP組注射 OM后JAK2，STAT3和SOCS3 mRNA表達水平明顯下調(diào)（P﹤0.05），而OP組、NC組和OM組之間均無統(tǒng)計學差異（P﹥0.05）。
　　結(jié)論：1 TGF-β1可通過促進JAK2/STAT3信號通路分子的表達和活化來激活PSC。2 OM可能通過抑制JAK2/STAT3信號通路來抑制胰腺組織纖維化發(fā)生。