氧化苦參堿對高糖誘導大鼠腎臟系膜細胞纖維化的影響.pdf

1、糖尿病腎病是糖尿病微血管病變之一，嚴重影響患者的生活質量，甚至危及患者的生命。探究糖尿病腎病的發(fā)生機制及如何延緩糖尿病腎病勢在必行。糖尿病腎病的病變特點包括腎小球肥大，細胞外基質(extracellularmatrix ECM)增多及異常沉積，不斷進展的腎小管間質纖維化以及終末期腎小球硬化。其中，腎間質纖維化是疾病進展的關鍵環(huán)節(jié)，以大量的細胞外基質(ECM)聚集為特征。研究表明，轉化生長因子β1(transforming growthf

2、actor beta-1 TGF-β1)是作用最強的致腎纖維化細胞因子，TGF-β1/Smads信號轉導通路介導TGF-β1的致纖維化作用[1]。結締組織生長因子(connective tissue growth factor CTGF)是TGF-β1的下游因子，可調節(jié)成纖維細胞的生長和ECM的分泌，在腎臟纖維化中發(fā)揮重要作用[2]。
　　骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(Bone morphogenetic protein-7 BMP-7)是

3、TGF-β超家族的亞群之一，具有顯著的腎臟保護作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)BMP-7通過多種途徑發(fā)揮腎臟保護作用，并且能夠抑制TGF-β1/Samds信號轉導通路，具有強大的抗纖維化作用，且這一作用是獨立于腎臟保護作用的[4]。氧化苦參堿(Oxymatrine OMT)，分子式為C15 H24N2O，是從中藥苦參、苦豆子及廣豆根中提取的一種中藥單體，藥理作用廣泛，如抗病毒、抗炎、調節(jié)免疫及抗纖維化等作用。我們的前期研究證實:糖尿病腎病模型大鼠腎

4、小球Smad1的表達增加，腎小球系膜內基質集聚，CTGF的含量增加。既往研究發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿具有改善腎臟纖維化的作用，但氧化苦參堿通過何種機制發(fā)揮抗纖維化作用仍不明確，由此我們提出假設，氧化苦參堿是否通過影響細胞外基質積聚來逆轉腎臟纖維化呢？
　　本研究擬通過高糖誘導建立大鼠系膜細胞纖維化模型，應用氧化苦參堿干預大鼠系膜細胞纖維化模型，測定模型中Ⅳ型膠原蛋白含量及BMP-7、TGF-β1、CTGF、Smad2、Smad3、Smad7

5、表達水平，在細胞水平探討B(tài)MP-7及TGF-β1/Smads信號通路與腎臟纖維化的關系，揭示氧化苦參堿改善糖尿病腎臟間質纖維化的分子機制，為臨床用藥提供理論依據。
　　目的:研究氧化苦參堿對高糖誘導大鼠腎臟纖維化的影響，探討氧化苦參堿改善腎臟纖維化的機制。
　　方法:15％胎牛血清的低糖培養(yǎng)基(5.SmM+雙抗)培養(yǎng)大鼠腎臟系膜細胞，培養(yǎng)細胞至貼壁生長60％時隨機分為兩組:正常對照組(NC)和高糖培養(yǎng)基組(HG)，正常對照組

6、采用無血清低糖培養(yǎng)基(5.5mM)培養(yǎng)，高糖培養(yǎng)基組則采用無血清高糖培養(yǎng)基(30mM)培養(yǎng)。建立高糖誘導的大鼠系膜細胞纖維化模型，將高糖培養(yǎng)基組隨機分為高糖組、氧化苦參堿低(O-L0.04 mg/ml)、中(O-M0.08 mg/ml)、高(O-H0.16 mg/ml)劑量組及坎地沙坦(Con0.005mg/ml)組，正常對照組仍給予無血清低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別干預24小時、48小時、72小時后，觀察各組細胞形態(tài)學變化;MTT比色法檢測各

7、組細胞存活率;用ELISA方法測定培養(yǎng)基上清液中Ⅳ型膠原蛋白的含量，確定造模成功。于氧化苦參堿及坎地沙坦干預48小時后，電鏡觀察藥物干預后系膜細胞形態(tài)變化;采用Real-Time PCR檢測大鼠腎臟系膜細胞BMP-7、CTGF、TGF-β1、 Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表達水平;Western-blot檢測系膜細胞BMP-7、CTGF、TGF-β1、p-Smad3及Smad3的蛋白表達水平。
　　結果:
　

8、　1、高糖刺激大鼠系膜細胞后，細胞形態(tài)及相關指標的變化
　　(1)細胞形態(tài):大鼠系膜細胞經高糖分別干預24小時、48小時、72小時后，與Con組相比，HG組細胞形態(tài)改變，三組間形態(tài)無明顯差異。
　　(2)Ⅳ型膠原蛋白含量:HG組培養(yǎng)基上清液中ⅣV型膠原蛋白的含量明顯高于正常對照組（P＜0.05），提示高糖誘導系膜細胞纖維化造模成功;分別用高糖培養(yǎng)24小時、48小時、72小時后大鼠系膜細胞培養(yǎng)基上清液中Ⅳ膠原蛋白的含量有上升趨

9、勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示高糖誘導系膜細胞纖維化可隨時間延長有上升趨勢，但程度有限。
　　(3)BMP-7、TGF-β1/Smads信號通路高糖干預48小時后，BMP-7、Smad2、Smad7的mRNA及蛋白表達水平與正常組相比明顯降低(P＜0.05); TGF-β1、Smad3、CTGF的mRNA及蛋白表達水平明顯高于正常組(P＜0.05），表明高糖可以促進系膜細胞纖維化的發(fā)生。與正常組相比，高糖組Smad2

10、/Smad3比值減小， p-Smad3/Smad3比值顯著升高，均具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。
　　2、藥物干預48小時后，細胞形態(tài)、Ⅳ型膠原蛋白、BMP-7及TGF-β1/Smads信號通路各項指標的變化
　　(1)細胞形態(tài):藥物干預后細胞形態(tài)有所恢復，但仍區(qū)別于正常對照組。
　　(2)Ⅳ型膠原蛋白含量:氧化苦參堿及坎地沙坦各干預組Ⅳ型膠原蛋白的含量均明顯低于高糖組(P＜0.05），但仍高于正常對照組(P＜0.0

11、5);Ⅳ型膠原蛋白的含量隨氧化苦參堿劑量增加而逐漸減少，提示氧化苦參堿具有改善腎臟纖維化的作用，其改善作用具有明顯的濃度依賴性?？驳厣程菇档廷粜湍z原蛋白含量的作用優(yōu)于氧化苦參堿(P＜0.05）。
　　(3)BMP-7、TGF-β1/Smads信號通路基因轉錄水平
　　與高糖組相比，氧化苦參堿及坎地沙坦各干預組BMP-7、Smad2、Smad7 mRNA水平明顯增加(P＜0.05），但仍低于正常對照組(P＜0.05）;TGF-

12、β1、Smad3、CTGF mRNA的水平明顯降低（P＜0.05），高于正常對照組(P＜0.05）;氧化苦參堿各劑量組及坎地沙坦組Smad2/Smad3比值明顯高于高糖組(P＜0.05）。
　　(4)BMP-7、TGF-β1、CTGF、p-Smad3/Smad3蛋白表達水平
　　與高糖組相比，氧化苦參堿及坎地沙坦各干預組BMP-7蛋白表達水平升高(P＜0.05），其中，氧化苦參堿高劑量組BMP-7蛋白表達水平與正常對照組相比

13、不具有統(tǒng)計學差異(P＞0.05），氧化苦參堿中、高劑量組仍低于正常對照組(P＜0.05）。藥物干預組CTGF、TGF-β1的蛋白表達水平低于高糖組(P＜0.05），但仍高于正常對照組(P＜0.05）;相比于高糖組，氧化苦參堿及坎地沙坦各干預組p-Smad3/Smad3蛋白表達明顯下降(P＜0.05），但高于正常對照組(P＜0.05）。氧化苦參堿干預后系膜細胞纖維化程度改善。
　　結論:
　　1、氧化苦參堿可以改善高糖刺激的大