JAK-STATs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在阿霉素腎臟纖維化大鼠模型中的研究及苦參堿對(duì)STAT3的影響.pdf

1、腎臟纖維化是各種原因腎臟疾病進(jìn)展到慢性腎衰竭的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)，是各種腎小球病變發(fā)展至終末期的一種不可逆的病理改變，包括腎小球硬化、腎小管萎縮和毀損、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)異常增多和過(guò)度沉積等病理過(guò)程，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明晰，治療難度大，預(yù)后較差，因此探討腎小球硬化機(jī)制及防治措施在臨床上有很重要的意義。 腎小球硬化初期表現(xiàn)為局灶節(jié)段性，后期則表現(xiàn)為彌漫性球狀分布，其病理演變過(guò)程分為腎小球肥大期、系膜硬化期、血管腔閉塞期，這一

2、演變過(guò)程是許多腎臟疾病進(jìn)展到腎衰竭的共同道路[1]；JAKs/STATs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)生物學(xué)功能的主要途徑之一，它已成為當(dāng)前細(xì)胞因子研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STATs)作為JAKs的靶蛋白，是存在于胞質(zhì)中的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，STAT3是該家族的重要成員，是一類由細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等多肽類配體激活的轉(zhuǎn)錄因子。研究表明STAT3途徑不僅是參與腎臟生理過(guò)程中是的一個(gè)很重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而且參與多種增生性

3、腎小球疾病有關(guān)[2,3]。 苦參堿(matrine)是藥用豆科槐屬植物苦參(Sophora flavescens Ait)的干燥根分離提取的生物堿，有多方面的藥理作用和功效，如抗菌、抗炎、抗風(fēng)濕、抗腫瘤、抗過(guò)敏、抗心律失常、消腫利尿、免疫及生物反應(yīng)調(diào)節(jié)作用等。研究發(fā)現(xiàn)苦參堿可降低腎病綜合征大鼠的蛋白尿和管型尿，減輕腎臟病理改變、減少足細(xì)胞融合，對(duì)TGF-β1的產(chǎn)生及Smad信號(hào)通路有一定的影響。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)苦參堿具有就抑制成纖

4、維細(xì)胞及膠原合成，防治實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化的作用。但其對(duì)腎小球硬化作用及機(jī)制目前尚未完全明晰。阿霉素所致的腎小球硬化動(dòng)物模型是一穩(wěn)定的腎小球硬化模型，以大量蛋白尿?yàn)橥怀鎏攸c(diǎn)，具有慢性進(jìn)展性腎損害的特點(diǎn)，與人類進(jìn)行性腎臟疾病的表現(xiàn)非常類似。 本課題擬觀察腎小球硬化過(guò)程中大鼠腎臟STAT1、STAT3、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、Ⅳ型膠原(COL-Ⅳ)的變化及JAK2、STAT1、STAT3mRNA的表達(dá)，考察JAKs/STAT

5、s信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腎小球硬化進(jìn)程中的變化；同時(shí)觀察了該模型大鼠經(jīng)苦參堿干預(yù)治療后腎組織STAT3、TGF-β1蛋白表達(dá)及STAT3、PIAS3mRNA表達(dá)，探討苦參堿在腎小球硬化治療作用及其機(jī)制，為臨床防治腎小球硬化尋找新的途徑。 第一部分JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在阿霉素腎小球硬化大鼠模型中的研究目的：動(dòng)態(tài)觀察阿霉素腎小球硬化大鼠模型腎臟纖維化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路各信號(hào)分子的表達(dá)，探討JAK/STAT信

6、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路腎小球硬化發(fā)病機(jī)制中的作用。 方法：30只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組各15只，模型組左側(cè)腎切除及1周后尾靜脈注射阿霉素5mg/kg制備腎小球硬化模型；對(duì)照組行假手術(shù)及1周后尾靜脈注射同劑量蒸餾水，2、4、6周分批處死模型組及對(duì)照組各5只大鼠，檢測(cè)血清肌酐、尿素氮和24小時(shí)蛋白尿變化，HE和Masson染色觀察腎小球硬化指數(shù)變化，以免疫組化法觀察腎臟纖維化過(guò)程中大鼠腎臟STAT1、STAT3、TGF-

7、β1、COL-Ⅳ表達(dá)及采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)JAK2、STAT1、STAT3mRNA表達(dá)。 結(jié)果：模型組血清肌酐(123.3±20.9μmol/L)、尿素氮(25.8±3.8μmol/L)和24小時(shí)蛋白尿(58.9±9.7mg/d)從2周起逐漸增高，至第6周明顯高于正常對(duì)照組(68.3±8.3 μmol/L)、(14.8±2.0μmol/L)和(9.6±1.1mg/d)(P<0.05)；模型組腎小球硬化指數(shù)(71.7±

8、11.2％)明顯高于正常對(duì)照組(17.6±2.5％)(p<0.05)；TGF-β1、COL-Ⅳ在6周腎小球硬化大鼠模型腎皮質(zhì)表達(dá)(TGF-β1:2.196±0.394％；COL-Ⅳ：5.26±1.66)明顯多于對(duì)照組(TGF-β1:0.017±0.005％；STAT3:7.64±1.25％)(p<0.05)，呈逐漸升高趨勢(shì)，模型制備成功；STAT3(19.6±2.6％)蛋白從4周起表達(dá)較正常對(duì)照組(7.64±1.2％)明顯增高(p<0.

9、05)，主要以胞漿表達(dá)陽(yáng)性為主，部分呈胞核表達(dá)陽(yáng)性；但STAT1蛋白表達(dá)模型組(6.76±1.1％)與對(duì)照組(5.73±1.0％)無(wú)明顯差別；JAK2、STAT1、STAT3mRNA6周后模型組表達(dá)(7.28±1.53、4.13±0.34、5.06±0.26倍于對(duì)照組)明顯多于對(duì)照組(P<0.05)。 小結(jié)：JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了腎小球硬化形成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，伴隨著JAK2、STAT1、STAT3信號(hào)分子表達(dá)的增多以

10、及TGF-β1、COL-Ⅳ等蛋白表達(dá)增加，這條通路可能是介導(dǎo)腎臟細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積、腎臟纖維化發(fā)生及發(fā)展的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一。而STAT1 mRNA表達(dá)升高，STAT1蛋白表達(dá)卻升高不明顯，可能與體內(nèi)代償機(jī)制及蛋白質(zhì)-mRNA表達(dá)不同步有關(guān)。 第二部分苦參堿對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的腎小球硬化大鼠STAT3信號(hào)分子的影響目的：動(dòng)態(tài)觀察苦參堿對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的腎小球硬化大鼠STAT3分子及其抑制分子PIAS3變化的影響，探討苦參堿在腎小球硬化

11、發(fā)病進(jìn)程中的作用及其機(jī)制。 方法：45只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及試驗(yàn)組各15只，用單側(cè)腎切除加1wk后尾靜脈注射阿霉素(5mg/kg)的方法建立腎小球硬化大鼠模型，為模型組；只行手術(shù)不注射阿霉素為對(duì)照組；造模后即予苦參堿100 mg/kg·d灌胃干預(yù)治療為試驗(yàn)組。于2、4、6 wk分批處死每組各5只大鼠，以免疫組化檢測(cè)腎臟STAT3、TGF-β1表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)觀察STAT3、PIAS3 mR

12、NA表達(dá)。 結(jié)果：第6wk時(shí)，模型組腎小球硬化指數(shù)(71.7±11.2％)高于對(duì)照組(17.6±2.5％)及試驗(yàn)組(44.9±8.9％)(p<0.01)；模型組TGF-β1在腎皮質(zhì)表達(dá)(2.196±0.394％)多于對(duì)照組(0.017±0.005％)及試驗(yàn)組(0.750±0.089％)(p<0.01)，并呈逐漸升高趨勢(shì)；模型組STAT3蛋白(19.58±2.66％)表達(dá)較對(duì)照組(7.64±1.25％)增高(P<0.01)，試驗(yàn)組

13、(14.90±1.66％)較模型組(19.58±2.66％)降低(P<0.01)；模型組STAT3 mRNA表達(dá)為5.06±0.26倍于對(duì)照組，高于試驗(yàn)組的3.49±0.39倍(p<0.01)，而PIAS3 mRNA呈相反趨勢(shì)。 小結(jié)：苦參堿有抑制腎小球硬化進(jìn)展的作用，其作用機(jī)制可能為下調(diào)JAK/STAT通路信號(hào)分子STAT3及上調(diào)其抑制分子PIAS3的表達(dá)，降低TGF-β1的蛋白水平，從而延緩腎小球硬化進(jìn)程。 結(jié)論：

14、 1.JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了腎小球硬化形成的過(guò)程，其信號(hào)分子JAK2、STAT1、STAT3是其中重要的環(huán)節(jié)之一； 2.TGF-β1、COL-Ⅳ等蛋白可能通過(guò)直接刺激JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路JAK2、STAT1、STAT3信號(hào)分子的活化，來(lái)介導(dǎo)腎小球硬化的進(jìn)程；抑或JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)了TGF-β1、COL-Ⅳ等致纖維化因子的產(chǎn)生。 3.苦參堿可下調(diào)STAT3及上調(diào)其抑制分子PIAS3的