JAKs-STATs信號轉(zhuǎn)導通路在腎小球硬化中的作用及苦參堿對其影響的研究.pdf

1、以TGF-β、CTGF為代表的細胞因子在腎小球硬化過程中起重要作用，拮抗細胞因子的不良作用已成為防治腎小球硬化、延緩腎小球疾病進展中的重要環(huán)節(jié)。因此，加強對腎小球硬化相關(guān)細胞因子通路的研究是了解腎小球硬化機制，探索新的治療方法和手段的重要途徑。蛋白酪氨酸激酶(Janus Kinases/Just another Kinases，JAK)/信號傳導子和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducers and activators of t

2、ranscription，STAT)信號通路是一重要的細胞因子信號傳導通路。在腎小球硬化過程中的不同階段，炎癥因子和腎小球硬化相關(guān)細胞因子的釋放、ECM產(chǎn)生、腎固有細胞的活化及表型轉(zhuǎn)化可能有不同的JAKs/STATs信號通路參與，目前尚無該方面的研究報道，本研究將探尋JAKs/STATs信號通路在腎小球硬化的作用，為進一步揭示腎小球硬化的生物學機制提供理論依據(jù)。 苦參是甘肅省的道地藥材，系藥用豆科槐屬植物苦參(Sophora f

3、lavesceus Air)的干燥根，性寒味苦，具有清熱燥濕，利尿的功效，始載于我國最早的藥學文獻《神農(nóng)本草經(jīng)》。苦參堿(matrine)和氧化苦參堿(oxymatrine)化學分子式分別為C15H24N2O和Ci5H24N2O2，分子量分別為266和282，是苦參的主要活性成分，二者在一定條件下可以轉(zhuǎn)化，有多方面的藥理作用和功效，如抗炎、消腫利尿、免疫及生物反應調(diào)節(jié)作用等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿或氧化苦參堿具有抗肝臟纖維化和皮膚纖維的

4、作用。 導師課題組前期研究工作已經(jīng)從細胞實驗和在體動物實驗證實苦參堿在防治腎臟纖維化有一定作用。但其對腎小球硬化相關(guān)信號通路的影響和作用機制尚不十分清楚，為進一步探討苦參堿防治腎臟纖維化的作用機理，本研究擬通過在體動物實驗，探尋苦參堿對JAKs/STATs信號通路在阿霉素腎小球硬化大鼠中的作用。更加深入的了解苦參堿的作用機理，為開發(fā)新的防治腎纖維化的臨床藥物提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。 第一部分 JAKs/STATs信號轉(zhuǎn)導通路及

5、其內(nèi)源性抑制分子在腎小球硬化大鼠腎組織中的表達 目的：動態(tài)觀察腎小球硬化大鼠模型病理變化過程中JAKs/STATs信號轉(zhuǎn)導通路分子和內(nèi)源性抑制分子SOCS、PIAS的表達，探討腎小球硬化中JAKs/STATs信號轉(zhuǎn)導通路分子和內(nèi)源性抑制分子SOCS、PIAS的作用和可能機制，為進一步開展防治腎小球硬化研究提供實驗依據(jù)。 方法：60只wistar大鼠隨機分為兩組：模型組和正常對照組。模型組采用右側(cè)腎切除加1周后尾靜脈注射阿

6、霉素(5mg/kg)的方法建立腎小球硬化大鼠模型，設(shè)假手術(shù)組為正常對照組。2、4、6周分批處死每組各10只大鼠，檢測24小時蛋白尿、血清肌酐和尿素氮的變化，免疫組化檢測腎臟COL-IV、α-SMA表達，以確定成功制備腎小球硬化大鼠模型。采用免疫組化檢測腎臟STAT1、STAT3的定位表達，western-blotting檢測STAT1、P-STAT1、STAT3、P-STAT3蛋白的定量表達，采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)觀

7、察JAK1、JAK2、STAT1、STAT3、SOCS1、SOCS3、PIAS1、PIAS3mRNA表達。 結(jié)果： 1.與對照組相比，模型組血清肌酐、尿素氮和24小時蛋白尿從2周起逐漸增高，至第6周明顯高于對照組(P<0.01)。組織病理學染色觀察，模型組大鼠腎組織出現(xiàn)腎小球系膜基質(zhì)中度增多，伴局灶節(jié)段性腎小球硬化，部分腎小球球囊粘連，腎間質(zhì)可見炎性細胞侵潤。腎小球硬化指數(shù)明顯高于對照組(P<0.01)。模型組COL-I

8、V、α-SMA表達明顯高于對照組及試驗組(P<0.05)，呈逐漸升高趨勢：滿腎小球硬化大鼠模型制備成功。 2.Western-boltting結(jié)果顯示，模型組STAT1、P-STAT1蛋白隨著病程的發(fā)展表達逐漸增高，第4、6周時同對照組相比差異有顯著意義。STAT3、P-STAT3蛋白在第2周時表達增高，同對照組相比差異有顯著意義，隨后其表達逐漸降低。 3.經(jīng)熒光定量RT-PCR反應結(jié)果顯示，模型組JAK2mRNA的表達

9、在第2、4周顯著降低，于第6周增高，且較對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義。模型組STAT3mRNA的表達呈現(xiàn)出在第2周時顯著增高隨后表達逐漸降低的趨勢。模型組JAK1，STAT1，PIAS1mRNA的表達呈現(xiàn)出先增高后降低，再逐漸增高的趨勢，且較對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義。模型組SOCS1、SOCS3、PIAS3mRNA的表達在疾病過程中始終低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義。 結(jié)論： 1.JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導通路分子家族

10、在大鼠腎小球硬化模型中的表達是不同的。不同的信號分子在腎小球硬化的早、中、晚期表達趨勢并不相同，說明在腎小球硬化過程中激活該通路的細胞因子以及調(diào)節(jié)因素不同，各自對腎小球硬化的病理過程的形成起重要作用。 2.內(nèi)源性抑制分子SOCS和PIAS家族在腎小球硬化過程中也有重要的作用，它們在不同的病理階段表達不同，調(diào)節(jié)STAT分子的活化，它們的表達不足和過表達可能與腎小球硬化發(fā)展有關(guān)。 第二部分苦參堿對腎小球硬化大鼠腎組織JAKs

11、/STATs信號轉(zhuǎn)導通路分子及其內(nèi)源性抑制分子影響的研究 目的：觀察苦參堿對阿霉素誘導的腎小球硬化大鼠JAKs/STATs分子變化的影響，探討苦參堿防治腎小球硬化的機制。 方法：雄性SPF級Wistar大鼠90只，體重180-200g，隨機分成3組：對照組(假手術(shù)組)30只、模型組30只，苦參堿治療組(苦參堿注射液肌肉注射25mg/kg.d)30只。檢測各組術(shù)后第6周的尿蛋白、血清尿素氮、肌酐及腎組織病理改變，并應用免疫

12、組織化學方法檢測COL-IV、α-SMA、STAT1和STAT3蛋白質(zhì)在腎皮質(zhì)組織中的表達，以確定腎小球硬化模型的成功及苦參堿的防治效果。采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)觀察JAK1、JAK2、STAT1、STAT3、SOCS1、SOCS3、PIAS1、PIAS3mRNA表達。 結(jié)果： 1.苦參堿治療組的尿蛋白排泄量、血肌酐和尿素氮水平均低于模型組，腎小球硬化程度輕于模型組(P<0.05)，腎皮質(zhì)COL-IV、

13、α-SMA蛋白表達也低于模型組(P<0.05)。 2.苦參堿治療組的STAT1蛋白水平于2周末高于模型組，在6周低于模型組(P<0.05)，STAT3蛋白表達在個時間段均低于模型組(P<0.05)。 3.經(jīng)熒光定量PCR反應結(jié)果顯示，和模型組相比苦參堿治療組JAK2、STAT1、STAT3、PIAS1mRNA表達降低，SOCS1、SOCS3、PIAS3mRNA表達顯著增高 結(jié)論：苦參堿對腎小球硬化大鼠模型腎臟病變