TIMP-1抑制大鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡及與JAKs-STATs信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)系.pdf

1、腎臟固有細(xì)胞的增殖、分化和凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)的合成和降解在維持正常腎臟功能和腎臟疾病發(fā)生發(fā)展中起著極其重要的作用。組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor ofmetalloproteinase-1，TIMP-1)，能廣泛地抑制組織基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloDroteinases，MMPs)的活性，調(diào)節(jié)ECM的動(dòng)態(tài)平衡。近年來研究發(fā)現(xiàn)，TIMP-1還具

2、有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)組織新生血管的形成和影響機(jī)體免疫力等重要作用。JAKs(Just another kinases；Januskinases)/STATs(signal transductors and activator of transcriptions)信號(hào)傳導(dǎo)通路在細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控中也具有重要作用。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，TIMP-1可經(jīng)過P13K/AKT、MEK/ERK等細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。

3、但JAKs/STATs通路是否參與TIMP-1抑制大鼠腎小球系膜細(xì)胞(rat glomerular mesangial cell，RMC)凋亡，目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)第一部分以RMC作為研究對(duì)象，來探討TIMP-1抑制RMC凋亡是否與JAKs/STATs細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)。 用人正、反義TIMP-1重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染RMC，在無血清條件下，使用JAK2的特異性抑制劑AG490(50μmol/L)刺激24h，采用流式細(xì)胞術(shù)

4、檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(RT．PCR)觀察TIMP-1、Cyclin D1、Bcl-xl、P27kipl和JAK2 mRNA的表達(dá)；Western blot檢測(cè)胞漿中JAK2、STAT3、STAT5和其對(duì)應(yīng)的磷酸化蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1、未加AG490的未轉(zhuǎn)染組、正義TIMP-1轉(zhuǎn)染組及反義TIMP-1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞總凋亡率分別為(109±06)﹪、(7.08±0.43)﹪和(21.91±0.25)﹪；正義轉(zhuǎn)染組總凋亡率明

5、顯低于未轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，反義轉(zhuǎn)染組總凋亡率則顯著高于未轉(zhuǎn)染組(P<0.01)。加入AG490后，各組細(xì)胞的總凋亡率均明顯增加(P<0.01)。2、RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：在無血清條件下，未加AG490的各組細(xì)胞中，Cyclin D1、Bcl-xl mRNA在正義TIMP-1轉(zhuǎn)染組中最高，反義TIMP-1轉(zhuǎn)染組中最低：P27kiplmRNA在反義TIMP-1 轉(zhuǎn)染組中表達(dá)最高。加入AG490后，各組細(xì)胞TIMP-1、Cyclin

6、 D1和Bcl-xl mRNA表達(dá)均減少，P27kipl mRNA均增加。3、Western blot結(jié)果顯示：在無血清環(huán)境中，未加AG490的各組細(xì)胞中，P-JAK2、P-STAT3和P-STAT5在正義TIMP-1 轉(zhuǎn)染組中表達(dá)最高，在反-TIMP-1轉(zhuǎn)染組中最低；加入AG490后，上述蛋白表達(dá)較相應(yīng)未加AG490的組均明顯減少。以上結(jié)果提示：在無血清條件下，TIMP-1 可在蛋白水平上反饋激活 JAKs/STATs 信號(hào)通路，抑制

7、RMC發(fā)生凋亡。近年來，糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)的發(fā)病率在我國逐年上升。隨著病程的延長，往往累及全身多個(gè)器官，引起多種嚴(yán)重的并發(fā)癥，糖尿病。腎病(Diabetic Nephropathy，DN)就是其中之一。近年來的研究表明，高糖(High Glucose，HG)長期作用于腎臟，可引起腎臟氧化應(yīng)激(Oxidative Stress，OS)，通過JAKs/STATs信號(hào)通路，可加重腎臟纖維化的病理改變。TIMP-

8、1抑制MMPs活性和刺激細(xì)胞增殖抑制細(xì)胞凋亡的作用，可促進(jìn)組織纖維化的發(fā)生發(fā)展。但在DN的OS機(jī)制中，是否存在TIMP-1的參與，目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)第二部分探討HG條件下OS、JAKs/STATs信號(hào)通路和TIMP-1之間的關(guān)系。 在HG條件下，RMC分別使用NADPH氧化酶和JAK2的特異性抑制劑DPI和AG490刺激24h，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；RT-PCR觀察Bcl-xl、Cyclin D1．、P27kipl

9、、JAK2和ITIMP-1 mRNA的表達(dá)；Western blot檢測(cè)胞漿中JAK2、STAT3、STAT5和其對(duì)應(yīng)的磷酸化蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示：1、HG組(25mmol/L)、HG+AG490組(HG 25mmol/L+AG49050μmol/L)、HG+DPI組(HG 25mmol/L+DPI 0.32gmol/L) 和HG+AG490+DPI組(HG 25mmol/L+AG490 50μmol/L+DPI 0.32μmol/L)

10、的細(xì)胞總凋亡率分別為：(10.69+0.26)﹪、(20.52±0.51)﹪、(24.56±0.36)﹪和(26.01±0.28)﹪；與HG組相比，加入AG490或(和)DPI可顯著提高RMC總凋亡率。2、RT-PCR結(jié)果顯示：AG490或(和)DPI可使Bcl-xl、Cyclin D1、JAK2和TIMP-1 mRNA表達(dá)顯著減少，使P27kipl mRNA表達(dá)增加；同時(shí)可明顯增加(P27kipltuRNA/actin)/(Cycli