JAKs-STATs信號(hào)通路關(guān)鍵基因在家兔腸炎發(fā)生中的作用研究.pdf

1、家兔腸炎是養(yǎng)兔業(yè)中危害最嚴(yán)重的消化道代謝疾病。根據(jù)腸炎病因的來源，可以將腸炎分為已知病原體的腸炎（腸炎）和未知病因的腸炎（非特異性腸炎）兩大類。目前普遍認(rèn)為腸炎的發(fā)生主要與遺傳、免疫、環(huán)境等因素有關(guān)，然而相關(guān)發(fā)病機(jī)制尚不清楚，有待深入深究。JAKs-STATs信號(hào)通路廣泛參與機(jī)體細(xì)胞的增殖、分化、存活、凋亡，介導(dǎo)機(jī)體免疫調(diào)控和腫瘤發(fā)生等生命活動(dòng)過程，且有報(bào)道指出IL-23R-JAKs-STAT3信號(hào)通路與人類的炎癥性腸病(IBD)相關(guān)。

2、因此，本試驗(yàn)期望從JAKs和STATs兩大基因家族中，找到與家兔腸炎相關(guān)基因的cSNP，并探討JAKs-STAT3信號(hào)通路在家兔腸炎發(fā)病過程中的分子作用機(jī)制。本試驗(yàn)采用case-control實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以480只新西蘭兔(case253只，control227只)為試驗(yàn)對(duì)象，篩查JAK1，JAK2，TYK2，STAT1，STAT3和STAT5a基因的cSNP，并進(jìn)行JAK1，STAT3基因與腸炎易感性的關(guān)聯(lián)性分析;在低纖維日糧誘導(dǎo)家兔腸

3、炎群體中（60只），檢測JAK1，STAT3基因在回腸、結(jié)腸組織中的mRNA表達(dá)水平;通過培養(yǎng)家兔原代小腸上皮細(xì)胞(IEC)并用LPS構(gòu)建家兔IEC炎癥細(xì)胞模型;在炎癥細(xì)胞模型中篩選有效下調(diào)JAKs(JAK1，JAK2和TYK2)基因表達(dá)水平的高效siRNA分子和Westernblot檢測STAT3蛋白表達(dá)水平，并利用RAN-Seq技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染si-JAK1的IEC炎癥細(xì)胞模型組及對(duì)照組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本的測序驗(yàn)證，分析JAKs-STAT3在家兔

4、腸炎發(fā)病中的不同作用。獲得以下主要結(jié)果:
　　1.利用PCR產(chǎn)物純化后直接測序法，篩查新西蘭兔JAKs和STATs兩個(gè)家族六個(gè)基因的編碼區(qū)cSNP，共發(fā)現(xiàn)22個(gè)cSNP，分別是JAK13個(gè)，JAK21個(gè)，TYK25個(gè)，STAT15個(gè)，STAT34個(gè)和STAT5a4個(gè)。其中，JAK1 c.1421 C＞T和TYK2 c.1477 C＞T是非同義突變，分別導(dǎo)致氨基酸p.Thr474 Met(T＞M)和p.Leu404 Phe(L＞F)

5、的改變，其余的cSNP均為同義突變。通過非同義突變導(dǎo)致氨基酸損害程度分析和同義突變密碼子偏好性分析，選擇JAK1 c.1421，c.3036和STAT3 c.399，c.831四個(gè)cSNP進(jìn)行家兔腸炎case-control關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JAK1等位基因C(c.1421)和A(c.3036)分別是風(fēng)險(xiǎn)等位基因和保護(hù)等位基因;STAT3等位基因C(c.831)和G(c.399)分別是風(fēng)險(xiǎn)等位基因和保護(hù)等位基因。運(yùn)用多因子降維法(MD

6、R)分析JAK1(c.1421 C＞T、c.3036 A＞G)和STAT3(c.399 G＞A、c.831 T＞C)基因的遺傳交互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)四個(gè)cSNP組成8個(gè)遺傳交互作用模型，其中7個(gè)模型對(duì)家兔腸炎的易感性存在交互作用，模型(命名:c1421，c3036，c831)顯著地與家兔腸炎易感性相關(guān)(OR:2.7262;95％ CI:4.7408-5.1986;P＜0.0001)。
　　2.在低纖維日糧誘導(dǎo)試驗(yàn)的家兔群體中，熒光定量

7、PCR(qPCR)試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)JAK1(c.1421C＞T)基因在回腸和結(jié)腸中的嚴(yán)重組表達(dá)量最高，分別為0.2398±0.0145和0.1835±0.0175。JAK1基因在嚴(yán)重組回腸中的表達(dá)量極顯著高于健康組(P=0.0056)，顯著高于輕微炎癥組(P=0.039)。在回腸中CC基因型的表達(dá)量與CT和TT基因型表達(dá)量的差異分別達(dá)到顯著水平(P=0.031)和極顯著水平(P=0.0082);在結(jié)腸中只有CC基因型與TT基因型的mRNA表

8、達(dá)量呈現(xiàn)顯著相關(guān)(P=0.026)。STAT3(c.399 G＞A)基因在回腸和結(jié)腸中的嚴(yán)重組表達(dá)量最高，分別為0.3598±0.0249和0.2881±0.0671。STAT3基因在嚴(yán)重組回腸中的表達(dá)量極顯著高于健康組(P=0.0089)，顯著高于輕微炎癥組(P=0.013)，健康組和輕微組相互之間差異也達(dá)到顯著水平(P=0.045)。在回腸中AA基因型的表達(dá)量與GG基因型表達(dá)量的差異達(dá)到極顯著水平(P=0.0012);在結(jié)腸中AA基

9、因型與AG、GG基因型的mRNA表達(dá)量均呈現(xiàn)顯著相關(guān)(P=0.036，P=0.029)，而AG和GG基因型之間的mRNA表達(dá)水平差異不顯著(P=0.219)。
　　3.采用膠原酶Ⅰ（0.2mg/ml）成功分離培養(yǎng)家兔原代IEC，運(yùn)用相差消化法及相差貼壁法純化IEC，經(jīng)CK-18單克隆抗體鑒定其純度達(dá)95％以上。純化后的IEC培養(yǎng)體系中添加終濃度為1000ng/ml的LPS并作用24h，再利用ABC-ELISA法檢測到LPS模型組中

10、IL-1β、TNF-α兩個(gè)經(jīng)典的急性炎癥早期細(xì)胞因子含量均顯著高于同時(shí)段對(duì)照組(P＜0.01)，結(jié)果表明LPS誘導(dǎo)兔IEC炎癥細(xì)胞模型構(gòu)建成功。
　　4.利用陽性對(duì)照si-Pcontrol-GAPDH和熒光Cy3標(biāo)記的陰性對(duì)照si-Ncontrol05815確定了最佳脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體系，獲得能夠有效下調(diào)JAK1，JAK2和TYK2基因表達(dá)的siRNA分子(si-JAK1-001，si-JAK2-001和si-TYK2-003)。通過調(diào)

11、整siRNA轉(zhuǎn)染的終濃度，使其沉默靶基因的效率基本一致(70％)，通過qPCR檢測STAT3基因在已轉(zhuǎn)染高效siRNA的炎癥細(xì)胞模型中mRNA表達(dá)水平，以及利用Westeren blot分析p-STAT3(Tyr705)和STAT3總蛋白的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JAK1、JAK2、TYK2分別下調(diào)STAT3基因的mRNA表達(dá)水平為76.34％、23.89％和42.14％，分別下調(diào)p-STAT3表達(dá)水平0.71％，0.24％和0.35％，而總蛋

12、白水平卻沒有明顯變化，表明JAK1是導(dǎo)致STAT3(Tyr705)位磷酸化的主因。
　　5.通過RNA-Seq技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染si-JAK1-001的IEC炎癥細(xì)胞模型和對(duì)照組的測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用RNA fragmentation策略構(gòu)建測序文庫可以獲得良好的測序隨機(jī)性和較高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，與參考基因比對(duì)率約為40.05％，并且大約65％基因的Coverage達(dá)到90-100％。RNA-Seq基因差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)兩組重復(fù)試驗(yàn)有491個(gè)上

13、調(diào)基因，780個(gè)下調(diào)基因，涉及到壓力應(yīng)答，類固醇激素刺激應(yīng)答以及免疫系統(tǒng)發(fā)育等生物學(xué)過程。RNA-Seq進(jìn)一步證實(shí)si-JAK1-001可以有效沉默JAK1基因。Pathway顯著性富集分析揭示JAKs-STATs信號(hào)通路中相關(guān)基因的功能與家兔IEC炎癥細(xì)胞模型的免疫應(yīng)答相關(guān)，且JAK1選擇性顯著下調(diào)STAT1、STAT3、STAT5b基因的表達(dá)水平。
　　本研究著重揭示JAK1和STAT3基因與家兔腸炎易感性的關(guān)系;闡述JAK1