SLC38A1基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用研究.pdf

1、研究背景:胃癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，目前發(fā)病率在和死亡率一直居高不下。生存率低的主要原因是腫瘤發(fā)現(xiàn)晚及復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移所致。因此，提高胃癌生存率的根本途徑是早期診斷和治療。由于發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性以及腫瘤的異質(zhì)性等原因，傳統(tǒng)的TNM分期還不能準(zhǔn)確提示和預(yù)知胃癌個(gè)體的腫瘤變化信息。所以，從分子水平認(rèn)識(shí)胃癌的發(fā)病機(jī)制并尋找一些特征性標(biāo)志物，已成為胃癌診斷、治療的重要途徑。
　　 腫瘤形成(oncogenesis)的過程包括始發(fā)突變

2、、潛伏、促癌和演進(jìn)。惡性腫瘤的發(fā)生歸根到底是因?yàn)樵┗虻募せ詈鸵职┗虻墓δ軉适Аふ椅赴┫嚓P(guān)基因、構(gòu)建其基因表達(dá)譜是闡明胃癌的分子發(fā)病機(jī)制和進(jìn)行有效預(yù)防的有效途徑。本實(shí)驗(yàn)室前期應(yīng)用基因芯片研究胃癌和正常胃黏膜基因表達(dá)譜的差異，發(fā)現(xiàn)87個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)，140個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)，GO分類為12類，涉及腫瘤代謝、粘附、凋亡、細(xì)胞周期等促癌機(jī)制，部分基因在胃癌中的表達(dá)情況及具體機(jī)制不詳，值得進(jìn)一步研究。由于基因芯片有時(shí)穩(wěn)定性不佳，如：樣

3、本數(shù)量有限造成一定抽樣誤差，以及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法不同，可能導(dǎo)致結(jié)果差別很大等。因此，要篩選出有價(jià)值的基因還需要經(jīng)過多種方法的驗(yàn)證。為了進(jìn)一步從中篩選出有診斷判斷價(jià)值的基因，我們從基因芯片結(jié)果中選取了8個(gè)表達(dá)差異明顯的基因進(jìn)行了初步驗(yàn)證。通過Real-time PCR分析檢測(cè)，有7個(gè)基因的表達(dá)改變情況與芯片結(jié)果一致。結(jié)合查閱文獻(xiàn)及通過Western blot驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)在胃癌組織中顯著高表達(dá)的有價(jià)值基因，即SLC38A1基因。

4、>　　 SLC38A1基因?qū)儆诎被徂D(zhuǎn)運(yùn)載體家族，近來有研究發(fā)現(xiàn)某些氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，如食管癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)直腸腺癌、肝癌等，在胃癌中的研究未見報(bào)道。該家族基因的作用機(jī)制尚不明確，有學(xué)者推測(cè)可能是因其提供給細(xì)胞快速增殖所需要的必需氨基酸，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞快速生長(zhǎng)。例如，美國(guó)猶他大學(xué)研究人員在一份2009年《美國(guó)科學(xué)院院報(bào)》的研究報(bào)道中指出：體內(nèi)谷氨酰胺對(duì)腫瘤細(xì)胞吸收葡萄糖十分關(guān)鍵。假如沒有谷氨酰胺，腫瘤細(xì)胞

5、就會(huì)因?yàn)闊o法吸收葡萄糖而出現(xiàn)“短路”，從而無法正常生長(zhǎng)，即使只是限制谷氨酰胺的含量水平，也能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。而SLC38A1所屬的A型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)正是負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酰胺的重要轉(zhuǎn)運(yùn)體，其轉(zhuǎn)運(yùn)的其他氨基酸如丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸等也有報(bào)道證實(shí)與腫瘤相關(guān)。因此，是否由氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的異常表達(dá)導(dǎo)致了體內(nèi)氨基酸水平異常變化并促進(jìn)了腫瘤發(fā)生發(fā)展，值得進(jìn)一步研究。若能夠發(fā)現(xiàn)腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供給的根源并給予切斷，這一理念也符合“餓死”腫瘤細(xì)胞的治療方法，為

6、癌癥治療提供了新思路。
　　 目的:研究SLC38A1蛋白在中國(guó)胃癌人群中的表達(dá)情況及其臨床意義，并探討其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用機(jī)制。為進(jìn)一步明確胃癌發(fā)生發(fā)展過程中分子作用機(jī)理，以及尋找胃癌生物治療新的作用靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、前期應(yīng)用人類全基因組芯片篩選出一組胃癌及癌旁正常組織中差異表達(dá)基因，應(yīng)用Real-time PCR進(jìn)行初步驗(yàn)證，結(jié)合文獻(xiàn)選擇SLC38A1為目的基因，采用West

7、ernblot繼續(xù)驗(yàn)證該基因在人胃癌細(xì)胞系、新鮮胃癌組織樣本中的表達(dá)。
　　 2、構(gòu)建含1072例胃癌及癌旁正常組織的組織芯片，用免疫組織化學(xué)方法觀察胃癌與正常組織中SLC38A1的表達(dá)情況；并應(yīng)用SPSS13統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析該基因與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　 3、構(gòu)建SLC38A1基因shRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染SLC38A1高表達(dá)細(xì)胞株SH-10-TC，觀察沉默效率；采用細(xì)胞增殖分析、遷移實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)等體外方

8、法，比較干擾組si-SLC38A1與陰性對(duì)照組si-Ctl的增殖、遷移、侵襲能力及細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果：
　　 1、基因芯片雜交篩選發(fā)現(xiàn)一組胃癌及癌旁正常組織中差異表達(dá)基因，采用Real-time PCR初步驗(yàn)證芯片結(jié)果可靠。結(jié)合芯片結(jié)果及文獻(xiàn)，選取SLC38A1為目的基因，Western blot檢測(cè)20對(duì)胃癌及癌旁正常組織標(biāo)本提示該基因主要在胃癌中表達(dá)，在8種常見胃癌細(xì)胞系中都有高水平SLC38A1蛋白表達(dá)，且以S

9、H-10-TC細(xì)胞系最高。
　　 2、成功構(gòu)建21張胃癌組織芯片，癌組織中SLC38A1染色胞漿陽性細(xì)胞呈片狀和/或彌漫分布，癌旁組織中陽性細(xì)胞呈散在或片狀分布，且染色強(qiáng)度均弱于癌組織。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，癌組織SLC38A1的表達(dá)率高于癌旁正常組織(P＜0.05)。
　　 3、SLC38A1蛋白的表達(dá)水平與年齡(＞60years；P=0.004)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.013)、臨床分期(P＜0.001)、分化(P＜0.001

10、)和PCNA表達(dá)(P=0.002)均有關(guān)。
　　 4、成功構(gòu)建SLC38A1基因shRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染SH-10-TC細(xì)胞系后觀察CCK-8、Migration實(shí)驗(yàn)提示：SLC38A1基因沉默后細(xì)胞株較高表達(dá)SLC38A1者的增殖、遷移能力均下降(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、SLC38A1在常見胃癌細(xì)胞系中不同程度高表達(dá)，在胃癌組織中的mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于癌旁正常胃黏膜組織，為進(jìn)一步尋找新

11、的分子標(biāo)志物提供依據(jù)。
　　 2、組織芯片結(jié)果顯示SLC38A1主要在胃癌中表達(dá)，提示該基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，有可能成為腫瘤治療的良好預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。
　　 3、本研究將SH-10-TC細(xì)胞內(nèi)源性高表達(dá)的SLC38A1基因沉默后作了詳細(xì)細(xì)胞功能學(xué)研究，結(jié)果表明降低SLC38A1表達(dá)后能夠使得腫瘤細(xì)胞增殖、遷移能力下降。提示SLC38A1可能通過促進(jìn)腫瘤增殖、遷移能力參與了胃癌發(fā)生、發(fā)展過程。該實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步發(fā)掘新的靶點(diǎn)提