MYB基因在唾液腺腺樣囊性癌發(fā)生發(fā)展中作用及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、腺樣囊性癌(Adenoid cystic carcinoma，ACC)是唾液腺腫瘤中侵襲性最強(qiáng)的惡性腫瘤之一，約占唾液腺癌的21％-24％，具有嗜神經(jīng)生長的特性，超過60％的唾液腺腺樣囊性癌的患者會復(fù)發(fā)并伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。5年生存率較高，但10年甚至更長時(shí)間的生存率偏低，術(shù)后極易復(fù)發(fā)，治療較棘手。目前，臨床上對其沒有行之有效的治療方案。唾液腺腺樣囊性癌(SACC，Salivary glands Adenoid cysticcarcinoma

2、)對化療不敏感，其主要的治療手段為手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后放療。因?yàn)閷ΤＲ?guī)治療手段的治療效果并不滿意，我們需要進(jìn)一步了解SACC的生物學(xué)行為和分子遺傳學(xué)特征，試圖提供新的見解和治療策略。隨著對腺樣囊性癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)基因治療可能是腺樣囊性癌治療的突破點(diǎn)。通過對在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到調(diào)控作用的基因的研究，我們或許能夠以調(diào)控原癌基因的表達(dá)來抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡，最終達(dá)到治療SACC的目的。
　　腺樣囊性

3、癌的分子水平下的發(fā)病機(jī)制是十分復(fù)雜的過程，其中染色體6q和9q之間的易位((6;9)(q22-23;p23-24))具有十分重要的作用。Persson等研究者首次報(bào)道這種易位能夠?qū)е翸YB和NFIB基因融合，這種融合具有ACC特異性，占全部ACC發(fā)病原因中的86％，使其在分子水平有別于其他腫瘤。MYB-NFIB融合將導(dǎo)致MYB蛋白過表達(dá)，及MYB相關(guān)靶向基因的表達(dá)改變從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。目前，研究發(fā)現(xiàn)約40％人類SACC中都存在MYB-

4、NFIB基因融合，全基因組測序也證實(shí)了MYB基因的改變在SACC中普遍存在，同時(shí)也在SACC中檢測到NOTCH-1改變。NOTCH-1在不同腫瘤組織中作用不盡相同，促瘤和抑瘤作用同時(shí)存在，尚無其與MYB在SACC發(fā)生發(fā)展中之間相互作用的研究。另外，研究發(fā)現(xiàn)在不具有MYB-NFIB融合的SACC中也有超過50％具有完整長度MYB基因的過表達(dá)，而這種現(xiàn)象并不發(fā)生在唾液腺其他腫瘤中。另外，一些研究表明MYB與其下游信號通路的相互作用是導(dǎo)致SA

5、CC發(fā)生的重要因素。這些研究均提示MYB基因改變可能在SACC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。由于缺乏有效的研究模型，目前尚無MYB基因改變所引起的MYB過表達(dá)在SACC發(fā)生發(fā)展中作用的相關(guān)研究。
　　據(jù)此，我們假設(shè)MYB過度表達(dá)作為原癌基因“啟動子”在SACC發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)中我們采用TRE-MYB小鼠和MMTV-tTA小鼠進(jìn)行雜交建立唾液腺和乳腺特異性過表達(dá)MYB的TRE-MYB-M.tTA轉(zhuǎn)基因小鼠模型，進(jìn)一步研究MY

6、B基因在SACC發(fā)生發(fā)展中的作用，NOTCH-1是否與其共同影響這一過程。
　　本課題針對以上相關(guān)問題分為以下三個部分進(jìn)行研究:第一部分:建立TRE-MYB轉(zhuǎn)基因，使用TetO-MYB和CMV-rtTA質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過觀察其在多西環(huán)素作用下MYB的表達(dá)水平來對比小鼠和人類細(xì)胞對Tet-On系統(tǒng)的敏感性。在該系統(tǒng)的基礎(chǔ)之上進(jìn)一步建立TRE-MYB轉(zhuǎn)基因小鼠模型。將TRE-MYB小鼠與MMTV.tTA小鼠進(jìn)行雜交，從其后代中獲得

7、同時(shí)具有TRE-MYB和 MMTV.tTA基因的 TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠。在TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠中收集唾液腺腫瘤，從組織病理學(xué)角度對其進(jìn)行鑒定，并檢測其p63和c-KIT的表達(dá)水平;第二部分:對TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠所形成SACC的MYB表達(dá)水平進(jìn)行檢測，并觀察在多西環(huán)素抑制MYB表達(dá)后對SACC的影響，從而對MYB在SACC發(fā)生發(fā)展中作用進(jìn)行研究;第三部分:對TRE-MYB-M.

8、tTA(+/+)小鼠所形成SACC中NOTCH-1表達(dá)水平進(jìn)行檢測，研究其與MYB之間的相關(guān)性。初步探索SACC與其他相關(guān)腫瘤信號通路和腫瘤標(biāo)記物的關(guān)系。
　　第一部分 TRE-MYB-M.tTA小鼠模型建立及其形成唾液腺腺樣囊性癌鑒定
　　目的:
　　建立TRE-MYB-MtTA(+/+)轉(zhuǎn)基因小鼠模型并對所形成SACC進(jìn)行鑒定
　　方法:
　　使用CMV-rtTA和TetO-MYB質(zhì)粒對小鼠SCC和人類

9、ACC細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在多西環(huán)素的作用下觀察對比各細(xì)胞MYB的表達(dá)水平，確定TRE-MYB轉(zhuǎn)基因表征后進(jìn)一步建立TRE-MYB轉(zhuǎn)基因小鼠。將獲得的TRE-MYB小鼠與獲贈于美國內(nèi)布拉斯加醫(yī)學(xué)中心Dr.Wagner實(shí)驗(yàn)室的MMTV.tTA小鼠進(jìn)行雜交，在其后代中篩選出TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠并持續(xù)喂養(yǎng)。當(dāng)TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠SACC成瘤后，收集腫瘤，從組織病理學(xué)角度對其進(jìn)行診斷。同時(shí)，在蛋白水平對其p63

10、和c-KIT的表達(dá)進(jìn)行檢測。取小鼠正常唾液腺組織作為空白對照。
　　結(jié)果:
　　由CMV-rtTA和TetO-MYB質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的MYB的表達(dá)能夠受到多西環(huán)素的調(diào)控，并在此基礎(chǔ)上成功建立了TRE-MYB轉(zhuǎn)基因小鼠。通過TRE-MYB小鼠與MMTV.tTA小鼠雜交，在其后代成功篩選出TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠。TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠中共有9只小鼠成瘤，其中8只為唾液腺腫瘤（其中2只小鼠分別

11、形成2個腫瘤，共10例，留取1只成瘤小鼠進(jìn)行第二部分實(shí)驗(yàn)），1只為乳腺腫瘤，組織病理切片顯示9例唾液腺腫瘤均為SACC，1例乳腺腫瘤為乳腺癌。正常唾液腺組織、SACC和乳腺癌中均在蛋白水平不同程度表達(dá)p63?？瞻讓φ战M不表達(dá)或者低表達(dá)c-KIT，SACC均不同程度過表達(dá)c-KIT，乳腺癌不表達(dá)c-KIT。
　　結(jié)論:
　　成功建立TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠模型，其唾液腺所形成腫瘤均為SACC。TRE-MYB-M

12、.tTA(+/+)小鼠所形成SACC均不同程度的表達(dá)p63和c-KIT。
　　第二部分 TRE-MYB-M.tTA小鼠唾液腺腺樣囊性癌中MYB基因的表達(dá)
　　目的:
　　研究MYB基因改變導(dǎo)致MYB過表達(dá)是否是TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠形成SACC的原因。
　　方法:
　　取第一部分小鼠腫瘤，分別采用Weatern Blot和免疫組織化學(xué)染色對MYB的表達(dá)進(jìn)行檢測，已正常唾液腺組織和乳腺癌作為

13、對照。第一部分所留取的荷瘤小鼠采用含有2mg/ml多西環(huán)素的RO水持續(xù)喂養(yǎng)，測量初始腫瘤體積并每兩天測量一次。最后取其腫瘤組織切片進(jìn)行診斷，采用免疫組織化學(xué)染色對MYB表達(dá)進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果:
　　Western Blotting結(jié)果顯示9例TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠唾液腺腺樣囊癌和1例乳腺癌均過表達(dá)MYB。免疫組化結(jié)果顯示9例SACC均不同程度過表達(dá)MYB，乳腺癌中未見表達(dá)。多西環(huán)素喂養(yǎng)后的小鼠SACC初始

14、腫瘤體積為4767mm3，其體積隨天數(shù)增加明顯縮小，83天后其體積為1368 mm3。其病理組織切片診斷為SACC，免疫組化顯示存在MYB過表達(dá)但所表達(dá)的細(xì)胞數(shù)較少。
　　結(jié)論:
　　MYB基因改變導(dǎo)致MYB過表達(dá)可能是引起SACC發(fā)生發(fā)展的原因之一，抑制其表達(dá)能夠使腫瘤消退。
　　第三部分 TRE-MYB-M.tTA小鼠唾液腺腺樣囊性癌中NOTCH-1表達(dá)及其與MYB基因的相關(guān)性
　　目的:
　　研究MY

15、B是否與NOTCH-1基因協(xié)同作用促進(jìn)TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠SACC生成。初步探索SACC與其他相關(guān)腫瘤信號通路和腫瘤標(biāo)記物的關(guān)系。
　　方法:
　　取第一部分TRE-MYB-M.tTA(+/+)小鼠所形成唾液腺腺樣囊癌組織，分別采用Weatern Blot和免疫組織化學(xué)染色對NOTCH-1表達(dá)進(jìn)行檢測。采用Real-timePCR在mRNA水平上對Hes1、Hes5、Hey1和Hey2表達(dá)水平進(jìn)行檢測。<