唾液腺腺樣囊性癌XT-Ⅰ與XT-Ⅱ基因共沉默的實驗研究.pdf

1、目的:唾液腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是最常見的唾液腺惡性腫瘤之一，侵襲性強，可轉(zhuǎn)移，易復(fù)發(fā)，預(yù)后不佳，迄今尚無較理想的治療措施。
　　SACC中的腫瘤性肌上皮細胞（neoplastic myoepithelial cells，NMCs）可以分泌蛋白多糖（proteoglycans，PGs），構(gòu)成腫瘤的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)。在

2、SACC中，過多的ECM逐漸堆積，形成囊腔樣結(jié)構(gòu)，從而呈現(xiàn)出SACC特有的組織學(xué)特點。富含PGs的ECM，構(gòu)成了SACC細胞的大分子微環(huán)境(macromolecule microenvironment)。SACC細胞在這一微環(huán)境內(nèi)生存，繼而進展，出現(xiàn)增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等一系列生物學(xué)行為。目前認(rèn)為，PGs是SACC的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)和生物學(xué)行為必不可少的物質(zhì)基礎(chǔ)，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。
　　人木糖基轉(zhuǎn)移酶(xylosyltr

3、ansferase，XT)是人體PGs生物合成的起始酶和限速酶，催化此合成過程的效率—限制階段（rate-limited step），它的活性真實反映PGs的生物合成率。人XT有兩個亞型(isoform):XT-Ⅰ和XT-Ⅱ，催化作用幾乎相同，但是在人體不同細胞的表達有所差異。
　　RNA干擾（RNA interference，RNAi）是目前最有效的基因沉默(genesilencing)技術(shù)，可以特異、高效地阻斷特定基因的表達。

4、腺病毒載體是將外源基因?qū)爰毎麅?nèi)的常用媒介，同時表達一個以上目的基因的腺病毒載體，可同時發(fā)揮多個基因的功能，提高了腺病毒載體的利用率。
　　本研究擬構(gòu)建一個同時沉默XT-Ⅰ和XT-Ⅱ基因的質(zhì)粒載體，即編碼2條shRNA的干擾質(zhì)粒，腺病毒包裝，獲得重組腺病毒rAd5-shRNA-WJ7+WJ4;通過轉(zhuǎn)染SACC-83細胞，干擾XT-Ⅰ和XT-Ⅱ的表達，阻抑PGs合成，檢測其沉默效果;建立SACC-83的裸鼠移植瘤模型，瘤體內(nèi)注射重組

5、腺病毒，觀察其對移植瘤凋亡的影響。旨在探討SACC中XT-Ⅰ和XT-Ⅱ?qū)Gs的調(diào)控作用，以及XT-Ⅰ和XT-Ⅱ共沉默對細胞凋亡的影響，并為唾液腺肌上皮性腫瘤的生物治療提供更多的依據(jù)。
　　方法:
　　1.構(gòu)建分別靶向抑制人XT-Ⅰ基因和人XT-Ⅱ基因的兩個重組質(zhì)粒設(shè)計靶向抑制人XT-Ⅰ基因的shRNA-WJ4和靶向抑制人XT-Ⅱ基因的shRNA-WJ7的干擾位點和引物序列，合成shRNA-WJ4和shRNA-WJ7的單鏈目

6、的基因片段，分別與質(zhì)粒pGenesil-1.2和pGenesil-1.1的線性化載體連接，擴增質(zhì)粒，酶切鑒定，確定獲得重組質(zhì)粒pGenesil-1.2-shRNA-WJ4和pGenesil-1.1-shRNA-WJ7。
　　2.構(gòu)建同時靶向抑制人XT-Ⅰ基因和人XT-Ⅱ基因的共沉默質(zhì)粒雙酶切以上兩個重組質(zhì)粒，回收大小片段，W J7大片段與WJ4小片段的連接，擴增質(zhì)粒，酶切鑒定，測序驗證共沉默質(zhì)粒shRNA-WJ7+WJ4。

7、　　3.重組腺病毒質(zhì)粒的制備從質(zhì)粒pGenesil上通過LR體外同源重組將shRNA-WJ7+WJ4表達框轉(zhuǎn)移至pGSadeno腺病毒表達載體上，擴增質(zhì)粒，酶切鑒定。
　　4.包裝共沉默重組腺病毒制備線性化腺病毒DNA，連接重組腺病毒質(zhì)粒片段，轉(zhuǎn)染HEK293細胞，放大培養(yǎng)共沉默重組腺病毒rAd5-shRNA-WJ7+WJ4。
　　5.構(gòu)建陰性對照重組腺病毒rAd5-shRNA-HK。
　　6.重組腺病毒轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)S

8、ACC-83細胞，分3組:SACC-83-WJ7+WJ4組（沉默組）、SACC-83-HK組（空載體組）、SACC-83組（未轉(zhuǎn)染組），確定最佳MOI值為100，細胞轉(zhuǎn)染48 h的熒光最強，計算轉(zhuǎn)染率。
　　7.檢測轉(zhuǎn)染48 h后3組細胞XT-(Ⅰ)和XT-ⅠmRNA的表達TRIzol法提取細胞總RNA，測定RNA純度、濃度、完整性，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，實時熒光定量PCR(Real-Time PCR)檢測3組細胞XT-Ⅰ和X

9、T-Ⅰ mRNA的相對表達量，計算沉默率。
　　8.檢測轉(zhuǎn)染48 h后3組細胞培養(yǎng)液中PGs的含量用標(biāo)準(zhǔn)品建立濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，生物染色法測定PGs含量，計算抑制率。
　　9.裸鼠移植瘤模型的建立及分組4周齡雌性BALB/c-nu裸小鼠32只，14～15 g，無特定病原體(specificpathogen-free，SPF)條件飼養(yǎng)，每只于左側(cè)背部接種SACC-83細胞2.5×106個/250μl;62 d后，選取瘤體最

10、長徑在1 cm以上的24只，隨機數(shù)字表法分為3組:SACC-83-WJ7+WJ4組（沉默組）、SACC-83-HK組（空載體組）、SACC-83組（未轉(zhuǎn)染組），每組8只。
　　10.重組腺病毒裸鼠移植瘤內(nèi)注射接種腫瘤細胞后62 d，首次瘤內(nèi)注射重組腺病毒，SACC-83-WJ7+WJ4組（沉默組）注射共沉默腺病毒rAd5-shRNA-WJ7+WJ4，SACC-83-HK組（空載體組）注射陰性對照腺病毒rAd5-shRNA-HK，S

11、ACC-83組（未轉(zhuǎn)染組）注射PBS，每只4×109 PFU/200μl，每周注射一次，共5次。
　　11.標(biāo)本采集
　　3組裸鼠首次注射腺病毒5周(36 d)，斷頸處死，分離移植瘤，測量體積，新鮮瘤組織立即分切為4份，1份-80℃凍存，3份用于以下實驗。
　　12.流式細胞術(shù)樣品制備和凋亡檢測70％冷乙醇固定標(biāo)本，剪碎法+網(wǎng)搓法制備單細胞懸液，PI染色，流式細胞術(shù)檢測3組樣品的細胞凋亡情況。
　　13.HE染色

12、樣品制備和觀察10％福爾馬林固定標(biāo)本、石蠟包埋、切片、HE染色、光學(xué)顯微鏡觀察3組標(biāo)本的形態(tài)學(xué)變化。
　　14.透射電鏡超薄切片樣品制備和觀察標(biāo)本分切至小于1 mm3，4％戊二醛前固定、1％鋨酸后固定、環(huán)氧樹脂包埋、超薄切片、醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色30 min、透射電鏡觀察細胞凋亡情況。
　　結(jié)果:
　　1.分別靶向XT-Ⅰ、XT-Ⅱ和陰性對照的siRNA序列設(shè)計結(jié)果shRNA-WJ4 CAGGCAGCCCATCAA

13、ACCTshRNA-WJ7 CGTCTCCTCAAGGCCGTTTATshRNA-HK GACTTCATAAGGCGCATGC。
　　2.酶切和瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果、測序驗證結(jié)果均證明質(zhì)粒正確。
　　3.重組腺病毒轉(zhuǎn)染SACC-83細胞的效率重組腺病毒轉(zhuǎn)染后48 h，以表達綠色熒光的細胞作為成功轉(zhuǎn)染的細胞，SACC-83-WJ7+WJ4組（沉默組）與SACC-83-HK組（空載體組）的轉(zhuǎn)染率分別為98.7％和99.1％。<

14、br>　　4.Real-Time PCR檢測XT-Ⅰ和XT-Ⅱ的沉默效果轉(zhuǎn)染后48 h，SACC-83-WJ7+WJ4組(沉默組)XT-Ⅰ和XT-Ⅱ的mRNA相對表達量明顯低于SACC-83-HK組（空載體組）與SACC-83組（未轉(zhuǎn)染組），SACC-83-HK組與SACC-83組之間無差別。SACC-83-WJ7+WJ4組XT-Ⅰ和XT-Ⅱ的沉默率分別為97.3％和88.0％。
　　5.XT-Ⅰ和XT-Ⅱ基因共沉默對SACC-8

15、3細胞PGs合成分泌的影響轉(zhuǎn)染后48 h，SACC-83-WJ7+WJ4組（沉默組）細胞培養(yǎng)液中PGs含量明顯低于SACC-83-HK組（空載體組）和SACC-83組（未轉(zhuǎn)染組），抑制率為68.61％，SACC-83-HK組PGs未受到抑制。
　　6.裸鼠移植瘤最終體積首次注射腺病毒后5周，3組裸鼠移植瘤體積無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　7.流式細胞術(shù)測定裸鼠移植瘤細胞凋亡率首次注射腺病毒后5周，3組裸鼠移植瘤細胞凋亡率無統(tǒng)計學(xué)差異。

16、
　　8.光學(xué)顯微鏡觀察裸鼠移植瘤形態(tài)學(xué)變化首次注射腺病毒后5周，光鏡觀察裸鼠移植瘤HE染色石蠟切片，3組間未見明顯的形態(tài)學(xué)差異，均未觀察到顯著的細胞凋亡現(xiàn)象。
　　9.透射電鏡觀察裸鼠移植瘤細胞凋亡現(xiàn)象首次注射腺病毒后5周，SACC-83-WJ7+WJ4組（沉默組）易見細胞凋亡現(xiàn)象，其余兩組較少。
　　結(jié)論:
　　1.重組腺病毒rAd5-shRNA-WJ7+WJ4能夠有效誘導(dǎo)SACC-83細胞XT-Ⅰ和XT-Ⅱ