RNAi沉默人唾液腺腺樣囊性癌SACC-83細(xì)胞bcl-2基因的研究.pdf

1、目的:
　　唾液腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是唾液腺最為常見的惡性腫瘤之一，發(fā)生于唾液腺的任何部位。腫瘤惡性程度高，容易沿神經(jīng)、血管浸潤性生長，術(shù)后常復(fù)發(fā)，也可發(fā)生肺、骨、腦和肝等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。由于腫瘤的惡性生物學(xué)行為，直接威脅患者生命，目前術(shù)后尚無有效的治療方法。
　　B淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2，bcl-2)基因

2、是一種抑制細(xì)胞凋亡的癌基因，在眾多凋亡相關(guān)基因中bcl-2是目前最受關(guān)注的基因之一。定位于人的濾泡性淋巴瘤和正常B淋巴細(xì)胞染色體18號21區(qū)，含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，可編碼26kD的bcl-2α和22kD的bcl-2β兩種蛋白，其中bcl-2α是抑制凋亡作用發(fā)揮的主要蛋白，為線粒體膜的整合蛋白。它最先是在人類濾泡型淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是人類濾泡型淋巴瘤的細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)志，但后來研究發(fā)現(xiàn)，它在人類腫瘤中有廣泛意義。在許多腫瘤組織中，bcl

3、-2基因的表達(dá)水平通常會發(fā)生改變，它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。
　　RANi(RNA interference)即RNA干擾，是目前應(yīng)用較廣的一種基因研究技術(shù)，是由外源或內(nèi)源的雙鏈RNA（double strand RNA，dsRNA）導(dǎo)入細(xì)胞而引起的與dsRNA同源的mRNA降解，從而抑制其相應(yīng)的基因表達(dá)。RNAi具有高特異性、高效性、高穩(wěn)定性、可遺傳性、可擴(kuò)散性和濃度時(shí)間依賴性等特點(diǎn)。利用RNAi技術(shù)，在RNA水平特異性抑

4、制特定基因的表達(dá)，使特定基因獲得功能性喪失，從而成為研究基因功能的良好工具。
　　本實(shí)驗(yàn)采用RNA干擾（RNAi）技術(shù)特異性沉默人唾液腺腺樣囊性癌SACC-83細(xì)胞中的bcl-2基因，探討基因沉默后SACC-83細(xì)胞的形態(tài)變化及凋亡情況。
　　方法:
　　1重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定:武漢淅瑪生物技術(shù)公司受本實(shí)驗(yàn)室委托，設(shè)計(jì)并構(gòu)建重組腺病毒包裹的shRNA-bcl-2，使用雙酶切進(jìn)行鑒定。
　　2細(xì)胞培養(yǎng):采用含15

5、％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)人唾液腺腺樣囊性癌細(xì)胞株SACC-83。
　　3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及滴度測定:將腺病毒介導(dǎo)的shRNA真核表達(dá)載體shRNA-bcl-2（沉默組）和shRNA-HK（陰性對照）轉(zhuǎn)染SACC-83細(xì)胞，沉默其bcl-2基因的表達(dá)（最佳腺病毒滴度MOI為腺病毒∶細(xì)胞=50∶1）;未轉(zhuǎn)染shRNA真核載體的SACC-83細(xì)胞（未轉(zhuǎn)染組）作為空白對照。
　　4bcl-2基因沉默效率的檢測:采用Real-T

6、ime PCR技術(shù)，從mRNA水平檢測基因沉默(RNAi)后SACC-83細(xì)胞中bcl-2基因的表達(dá)。
　　5細(xì)胞凋亡檢測:利用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測SACC-bcl-2細(xì)胞、SACC-HK細(xì)胞、SACC-83細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果:
　　1成功構(gòu)建重組腺病毒包裹的shRNA真核表達(dá)載體shRNA-bcl-2.
　　2腺病毒介導(dǎo)的shRNA真核表達(dá)載體shRNA-bcl-2轉(zhuǎn)染SACC-83細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率為98.1

7、8％; shRNA-HK轉(zhuǎn)染SACC-83細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率為94.10％。
　　3基因轉(zhuǎn)染48h后，Real-Time PCR時(shí)實(shí)定量檢測發(fā)現(xiàn)，腺病毒介導(dǎo)的shRNA-bcl-2對SACC-83細(xì)胞中的bcl-2基因mRNA的沉默效率為90.19％。
　　4流式細(xì)胞術(shù)檢測SCCC-83-bcl-2組（沉默組）、SACC-83-HK組（空載體組）、SACC-83組（未轉(zhuǎn)染組），細(xì)胞凋亡率分別為8.45±0.25、4.26±0.2