紡錘體與動粒相關蛋白-1在唾液腺腺樣囊性癌中的作用及機制的研究.pdf

1、研究背景:
　　唾液腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)，亦稱涎腺腺樣囊性癌，是頭頸部一個重要的上皮源性惡性腫瘤，約占唾液腺惡性腫瘤的21-24％以及頭頸部惡性腫瘤的1％左右。本病病程雖然進展緩慢但局部侵襲能力很強、血行性轉移率高，容易侵犯周圍神經(jīng)和脈管，具有較高的復發(fā)率及遠處轉移率，尤其是易轉移至肺部、骨及肝臟，其遠處轉移率可高達40％，被描述為頭頸部最具有破壞性及最難以預

2、測的腫瘤之一。雖然目前手術完全切除和輔助化療已被證明可改善患者的長期生存率，但腺樣囊性癌的預后仍然較差，局部復發(fā)及遠處轉移仍時有發(fā)生，即使是經(jīng)過了根治性的手術切除及綜合序列治療后，或是原發(fā)部位已經(jīng)得到良好控制后。腺樣囊性癌的惡性增殖、轉移對其復發(fā)具有重要影響，因此，尋找控制腺樣囊性癌增殖的作用靶點，對其治療、預后具有重要意義，而有絲分裂是真核細胞主要的增殖方式。
　　有絲分裂異常是大多數(shù)惡性腫瘤發(fā)生的共同特征。紡錘體和動粒相關蛋白

3、復合體亞基-1，或稱為紡錘體與動粒相關蛋白-1(the spindle andkinetochore-associated complex subunit1，SKA1)的是一個新近發(fā)現(xiàn)的與有絲分裂相關的基因。SKA1蛋白定位于有絲分裂期間紡錘絲和外動粒界面，參與構成的紡錘體與動粒相關蛋白復合體(spindle and kinetochore associated complex，SKA復合體)，是有絲分裂期間動粒與微管形成穩(wěn)定結合所必需

4、的組成部分。SKA復合體具有許多重要的功能，其能夠調節(jié)微管的解聚，從而牽動姐妹染色單體的極向移動，確保有絲分裂的順利完成。SKA復合體還具有沉默紡錘體檢測點的功能，SKA復合體或其成員的損耗能夠導致染色體排列不整齊或排列延遲，從而使檢測點依賴的有絲分裂阻滯于分裂中期。研究發(fā)現(xiàn)，通過小分子RNA干擾的方式減少SKA1的表達后，雖然不會明顯改變著絲粒的形態(tài)和結構，但會導致微管連結缺陷及染色體中期板集合延遲，引起嚴重的染色體分離缺陷?？梢姡琒

5、KA1及SKA復合體是確保有絲分裂順利完成的關鍵組件，在真核細胞有絲分裂過程中發(fā)揮著重要作用。
　　目前的研究表明SKA1與肝細胞癌、胃癌、膀胱癌、惡性神經(jīng)膠質瘤、非小細胞肺癌以及前列腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。采用RNA干擾技術沉默SKA1基因的表達后，發(fā)現(xiàn)上述惡性腫瘤的細胞增殖能力、克隆形成能力均明顯下降，多數(shù)腫瘤的細胞周期也發(fā)生明顯變化。多變量生存分析發(fā)現(xiàn)SKA1高表達是甲狀腺乳頭狀癌淋巴結無瘤生存及遠處轉移無瘤生

6、存的獨立預后因素。也有研究發(fā)現(xiàn)，SKA1在腫瘤細胞中的表達與p21、ERK2、Bcl-2、Bax和磷酸化Akt等多個因子的表達相關。此外，SKA1與化療藥物順鉑的耐藥也密切相關。上述研究表明，SKA1可能是通過多種機制影響腫瘤的惡性增殖及發(fā)生發(fā)展。提示SKA1基因有望成為一種新的腫瘤預后標志分子或腫瘤基因治療的新靶點，對其進行RNA干涉，有可能成為腫瘤基因治療的有效手段。目前，有關SKA1在頭頸部腺樣囊性癌中的相關作用尚未見有報道。本研

7、究擬通過檢測SKA1蛋白在頭頸部腺樣囊性癌組織中的表達，分析其與腺樣囊性癌臨床病理特征及預后的相關性;并進一步探討SKA1在腺樣囊性癌細胞惡性增殖、細胞周期及轉移侵襲中的分子機制，以期為臨床治療及預后判斷提供具有參考價值的科學理論依據(jù)。
　　第一部分:SKA1在頭頸部腺樣囊性癌中的表達及臨床意義的研究
　　研究目的:檢測SKA1在頭頸部腺樣囊性癌組織中的表達，分析SKA1表達的臨床意義。
　　研究方法:
　　1.

8、病例選擇:本研究選取了聊城市人民醫(yī)院2005年至2013年期間42例頭頸部腺樣囊性癌的石蠟包埋組織（其中40例納入隨訪研究）。同時收集20例癌旁組織作為對照組。所有患者術前均未進行放射治療、化療、激素治療以及其他任何抗腫瘤治療。經(jīng)兩名不知曉臨床病理資料的病理醫(yī)師確診為腺樣囊性癌的樣本納入研究。
　　2.免疫組化評估SKA1蛋白的表達:采用免疫組織化學SV(Super Vision)法判斷ACC腫瘤組織組及癌旁正常組織組中SKA1蛋

9、白的表達情況。免疫組織化學染色結果按照陽性細胞所占的百分比以及著色的深淺強度來進行綜合判斷。1）按照陽性細胞數(shù)占同類細胞數(shù)的百分比，可分為四組:①位于0-5％之間，為0分;②位于6-20％之間，為1分;③位于20-60％之間，為2分;④位于60-100％之間，為3分。2）按照陽性細胞的著色程度來判定評分:①細胞呈淺黃色顯色為0分;②細胞著色黃色為1分;③細胞著色為棕黃色定為2分;④細胞著色為紅褐色記為3分?？傮w評分=陽性細胞百分比評分×

10、細胞著色強度評分，將0-1分定為陰性（-）;2-4分計為陽性(+);＞4分計為強陽性(++)
　　3.統(tǒng)計學方法:采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對各臨床變量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間比較采用Pearson卡方檢驗，病例數(shù)n≤1者采用Fisher確切概率法，以(P＜0.05)為具有顯著性差異。
　　研究結果:
　　1.SKA1在腺樣囊性癌組織中的表達分布
　　SKA1在腺樣囊性癌組織中的陽性表達主要分布于腫瘤細胞內，包括

11、導管細胞和變異肌上皮細胞，而腫瘤間質內未見明顯著色。SKA1在腺樣囊性癌癌細胞中的陽性表達表現(xiàn)為胞漿及/或胞核中的黃色或棕黃色顆粒沉淀。大部分陽性病例表現(xiàn)為胞核及胞漿均有著色，但細胞核著色強度更明顯;個別病例則表現(xiàn)為僅胞漿存在著色。SKA1在腺樣囊性癌組織中的表達明顯高于其在癌旁正常組織中的表達，組間比較具有顯著性差異(P＜0.05)。
　　2.SKA1的表達與腺樣囊性癌臨床病理特征及預后的關系
　　臨床資料統(tǒng)計分析表明，S

12、KA1的表達在腺樣囊性癌TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期患者的陽性率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P＜0.05)，在SACC實性型中的表達水平明顯高于篩孔狀/管狀型(P＜0.05)。SKA1的表達與患者性別、年齡、有無淋巴結轉移、有無神經(jīng)侵襲以及患者5年生存率無明顯相關，差別無統(tǒng)計學意義。40例患者的5年生存率為52.5％。
　　結論:
　　SACC腫瘤組中高表達SKA1蛋白，且在晚期患者及實性組織病理類型中表達明顯增高，檢測SKA1的表達有助

13、于頭頸部腺樣囊性癌的診斷、治療和預后判斷。
　　第二部分:SKA1調控涎腺腺樣囊性癌細胞SACC-83增殖與轉移的分子機制
　　研究目的:驗證慢病毒介導的shSKA1是否能有效沉默涎腺腺樣囊性癌細胞SKA1基因的表達，探討SKA1調節(jié)頭頸部腺樣囊性癌惡性增殖及轉移侵襲的分子機制。
　　研究方法:
　　1.慢病毒感染及感染效率評估:涎腺腺樣囊性癌SACC-83細胞被分為三組:Con組（空白對照細胞）、Lv-shCo

14、n組（陰性對照組/無義序列慢病毒感染的細胞組）和Lv-shSKA1組（靶向SKA1的慢病毒感染細胞組）。按照MOI=10，分別加入Lv-shSKA1慢病毒和Lv-shCon陰性對照慢病毒。感染3天，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)表達情況，評估慢病毒對于腺樣囊性癌SACC-83細胞的感染效率。
　　2.熒光實時定量PCR(Real time PCR，qRT-PCR)檢測SKA1 mRNA的表達:按說明Trizol1 ml提取

15、總RNA，紫外分光光度法測定260 nm和280 nm兩個波長處的光吸收，計算RNA濃度，逆轉錄反應，β-actin為內參基因行PCR反應，按照2-ΔΔCt法取RQ值(RQ=2-ΔΔCt)對基因表達進行相對定量。
　　3.Western blot檢測SKA1沉默后相關蛋白的表達:收集各組SACC細胞，觀察細胞生長狀態(tài)良好，細胞融合率達到80％以上，常規(guī)進行細胞裂解和蛋白提取，以及樣品蛋白濃度測定。SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS

16、-PAGE電泳)、轉膜、加入一抗及二抗，按照ECL蛋白印跡顯色試劑盒使用說明進行化學發(fā)光。
　　4.MTT實驗檢測細胞增殖: MTT法檢測SKA1基因沉默后對腺樣囊性癌細胞增殖的影響，酶標儀測定595nm處的吸光值(OD595nm)，以時間為橫軸(X軸)，光吸收值為縱軸（Y軸），繪制腫瘤細胞生長曲線。
　　5.流式細胞儀(FIow cytometry, FCM)檢測細胞周期:收集慢病毒感染的處于對數(shù)生長期的各組SACC細胞，

17、按要求處理后PI（碘化丙啶）染色，過濾，上機，檢測各組細胞的細胞周期分布。
　　6.細胞傷口愈合實驗(Wound healing assay)檢測細胞遷移能力:分別收集處于對數(shù)生長期的各組SACC細胞，計數(shù)后接種到24孔板，常規(guī)培養(yǎng)至細胞單層融合，劃痕，無血清培養(yǎng)基繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h后測量劃痕距離。
　　7.細胞侵襲實驗（Transwell小室）檢測細胞侵襲能力:按要求處理各組細胞后接種到已鋪膠的Transwell小室，常

18、規(guī)培養(yǎng)24 h后甲醇固定，0.1％結晶紫染色貼附在膜下室面的細胞，計數(shù)隨機選取的5個高倍視野(40×)內的細胞。
　　研究結果:
　　1.免疫熒光顯微鏡下GFP陽性細胞計數(shù)結果顯示無義序列慢病毒感染的細胞組（Lv-shCon組）和目的基因RNAi靶點慢病毒感染的細胞組(Lv-shSKA1組)的感染效率均高于80％。qRT-PCR和Western blot檢測結果顯示，Lv-shSKA1組中SKA1的mRNA和蛋白表達水平均顯

19、著低于Lv-shCon組。
　　2.免疫印跡結果顯示，沉默SKA1的表達后與腺樣囊性癌細胞周期及轉移侵襲相關的各種蛋白出現(xiàn)異常表達。表現(xiàn)為p27蛋白的表達上調，CDK4、CyclinD1， Cyclin E1， Cyclin B1及Ndc80蛋白的表達下降;E-cadherin表達上升而N-cadherin和MMP-9表達下調。
　　3.MTT試驗結果顯示，與正常對照組和陰性對照慢病毒感染組相比，腺樣囊性癌SACC-83細胞

20、的Lv-shSKA1慢病毒感染組的細胞生長受到顯著抑制。
　　4.流式細胞術顯示，SKA1基因被沉默后，SACC-83細胞的細胞周期阻滯于S期。
　　5.細胞傷口愈合實驗檢測結果顯示，Lv-shSKA1慢病毒感染組細胞遷移距離明顯小于未轉染組SACC-83細胞和Lv-shCon組細胞。
　　6.Transwell小室體外侵襲實驗結果顯示，Lv-shSKA1慢病毒感染組的細胞穿過Matrigel膠貼附在膜下室面的細胞數(shù)明

21、顯少于正常對照組和陰性對照病毒感染組。
　　結論:
　　1.敲減SKA1基因在頭頸部腺樣囊性癌中的表達，可使細胞周期細胞周期阻滯于S期，有效抑制腫瘤細胞的增殖。
　　2.SKA1基因沉默可下調細胞周期相關基因Ndc80，CDK4，Cyclin D1，CyclinE1，Cyclin B1的表達而促進p27蛋白的表達，進而阻滯細胞周期進程而細胞生長。
　　3.敲減SKA1基因可促進E-cadherin但抑制N-cad