ROS激活紡錘體組裝檢查點(diǎn)的作用機(jī)制研究.pdf

1、氧自由基具有非常強(qiáng)的氧化作用。活性氧簇(Reactive Oxygen Species，ROS)是這一類物質(zhì)的統(tǒng)稱，主要包括過氧化氫、超氧陰離子和羥基自由基等。通常情況下，人們會(huì)把ROS與疾病和衰老聯(lián)系，因?yàn)樗軌蜓趸?xì)胞中許多組分，包括核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等，而這些物質(zhì)的氧化最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡與癌變。許多研究報(bào)道稱，ROS與許多病癥相關(guān)，包括缺血型再灌注損傷、動(dòng)脈粥樣硬化、激素缺陷導(dǎo)致的癌癥和慢性炎癥等等除了與一些疾病相關(guān)。ROS是細(xì)胞

2、內(nèi)正常的代謝副產(chǎn)物，已有報(bào)道其在細(xì)胞周期中的作用及影響。本課題就ROS在有絲分裂時(shí)期的作用做了初步探討，首次提出了活性氧簇（主要是H2O2）對(duì)于有絲分裂紡錘體組裝檢查點(diǎn)（Spindle Assembly Checkpoint，SAC）的激活。
　　細(xì)胞增殖過程是通過細(xì)胞周期往復(fù)進(jìn)行的。細(xì)胞的有絲分裂時(shí)期與間期組成了整個(gè)細(xì)胞周期。間期主要進(jìn)行有絲分裂相關(guān)物質(zhì)的積累，為細(xì)胞有絲分裂做準(zhǔn)備。有絲分裂是細(xì)胞周期中最重要的生命活動(dòng)，細(xì)胞經(jīng)過

3、有絲分裂來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的增殖，將染色體平均分配到兩個(gè)子代細(xì)胞中，維持了遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。細(xì)胞增殖是細(xì)胞生命活動(dòng)中最重要的特征之一，為了使其順利進(jìn)行，細(xì)胞內(nèi)存在一系列的調(diào)控機(jī)制，使這一過程在嚴(yán)格的監(jiān)控下無差錯(cuò)的完成。紡錘體組裝檢查點(diǎn)(SAC)是存在于有絲分裂前中期到中期的過渡階段，是細(xì)胞有絲分裂時(shí)期的最重要的檢查機(jī)制。其功能在于確保有絲分裂中期啟動(dòng)前所有染色體都被紡錘絲正確捕捉。細(xì)胞從有絲分裂前期到后期進(jìn)行過程中，經(jīng)過SAC的監(jiān)控，當(dāng)所有染色

4、體被正確捕捉，一切工作妥當(dāng)安排后，細(xì)胞才能順利進(jìn)入有絲分裂后期直至走出有絲分裂。當(dāng)SAC信號(hào)產(chǎn)生后，作用于效應(yīng)分子Cdc20，SAC蛋白BuRd1，BuRd3和Mad2與Cdc20結(jié)合形成有絲分裂檢查點(diǎn)復(fù)合物（Mitotic CheckpointComplex，MCC），MCC與后期促進(jìn)復(fù)合物/周期體（Anaphase-promotingComplex/Cyclosome，APC/C）相互作用，使后者呈關(guān)閉構(gòu)象而不能結(jié)合底物，導(dǎo)致后續(xù)進(jìn)

5、程不能順利進(jìn)行。SAC信號(hào)的產(chǎn)生主要來源于未被紡錘體正確捕捉的染色體，染色體上與紡錘體結(jié)合的動(dòng)粒組分發(fā)生變化、微管組裝異常以及動(dòng)粒微管的結(jié)合受到影響，是細(xì)胞中SAC信號(hào)持續(xù)激活的源頭。本文主要從動(dòng)粒-微管的連接這一方面討論ROS對(duì)SAC信號(hào)的激活，而CPC是這一過程中重要的復(fù)合物。
　　CPC(Chromosomal passenger complex)參與有絲分裂時(shí)期的許多細(xì)胞活動(dòng)，其早期主要定位于染色體，與一系列周期蛋白共同參

6、與有絲分裂早期的調(diào)控，而后移位至紡錘體中心區(qū)域，參與調(diào)控胞質(zhì)分離。CPC是由其核心激酶原件AuroraB與其它三個(gè)負(fù)責(zé)調(diào)控與定位的蛋白(INCENP、Survivin和Borealin)組成。INCENP是CPC復(fù)合物組裝的連接體，其氨基末端是復(fù)合物定位所必需的，與Survivin和Borealin的相關(guān)組分組成一個(gè)三體束，共同決定CPC在著絲粒（有絲分裂早期）和紡錘體中心區(qū)域（有絲分裂后末期）的定位。而Aurora B是CPC復(fù)合物發(fā)

7、揮作用的核心，它通過磷酸化相應(yīng)的底物減小紡錘體的張力進(jìn)而解聚錯(cuò)誤鏈接的動(dòng)粒與微管。在有絲分裂時(shí)期，細(xì)胞需要精確的染色體分離過程，這需要?jiǎng)恿Ｅc紡錘體微管雙向并且正確的結(jié)合。CPC復(fù)合物通過其激酶單元Aurora B在動(dòng)粒-微管結(jié)合的錯(cuò)配與修復(fù)中發(fā)揮重要的作用。CPC復(fù)合物發(fā)揮動(dòng)粒-微管錯(cuò)連修復(fù)作用的同時(shí)，產(chǎn)生許多未連接的動(dòng)粒，這一信號(hào)被SAC識(shí)別，激活了SAC信號(hào)通路。
　　本課題探討了ROS激活SAC進(jìn)而引起細(xì)胞有絲分裂時(shí)期阻滯的

8、現(xiàn)象和機(jī)理，發(fā)現(xiàn)ROS處理細(xì)胞后，細(xì)胞停滯在有絲分裂早期而不繼續(xù)向后進(jìn)行胞質(zhì)分裂。在探究其機(jī)理的過程中，發(fā)現(xiàn)ROS的作用對(duì)微管的組裝沒有影響，但阻礙了CPC復(fù)合物中Aurora B激酶部分功能的發(fā)揮，故而推測(cè)，ROS影響了Aurora B的部分激酶活性，妨礙了它在動(dòng)粒微管連接中的功能，從而激活SAC。主要本課題首次提出了ROS對(duì)于SAC激活的作用，進(jìn)而對(duì)有絲分裂進(jìn)程產(chǎn)生影響，并且在探尋其機(jī)理的過程中，從另外一個(gè)角度研究了Aurora B

9、激酶在細(xì)胞有絲分裂時(shí)期的功能。研究目的:本課題旨在揭示在細(xì)胞有絲分裂過程中ROS的作用，探究ROS對(duì)于細(xì)胞除了DNA氧化損傷外的影響，并尋找其作用機(jī)制。大部分的文獻(xiàn)報(bào)道都聚焦于ROS對(duì)于細(xì)胞的氧化損傷，以及與疾病發(fā)生的關(guān)系。主要探究了ROS對(duì)于細(xì)胞周期進(jìn)程的影響，越過它在間期對(duì)DNA氧化損傷，闡述了ROS在有絲分裂時(shí)期對(duì)有絲分裂進(jìn)程的影響，并初步探究了它的效應(yīng)靶點(diǎn)。研究內(nèi)容:本課題研究了ROS對(duì)于細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程的影響，分析相關(guān)的現(xiàn)象并

10、探究其作用機(jī)理。主要研究了H2O2對(duì)于細(xì)胞有絲分裂狀態(tài)和相關(guān)組分的影響，并分析了與SAC激活相關(guān)的CPC復(fù)合物的功能。最終將目光定于Aurora B激酶的活性，探究了ROS的作用機(jī)理。實(shí)驗(yàn)方法:實(shí)驗(yàn)中用H2O2與VK3作為ROS的來源刺激細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色后用熒光顯微鏡觀察核的狀態(tài)，并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的有絲分裂比例，以此來研究ROS對(duì)于細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程影響的現(xiàn)象。并MTT試劑盒檢測(cè)了不同細(xì)胞對(duì)于H2O2的耐受狀況。在探究機(jī)理過程中，用免疫熒

11、光實(shí)驗(yàn)方法觀察微管組裝以及Aurora B的定位，用免疫印跡的方法分析相關(guān)蛋白的分子水平以及修飾水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:在H2O2處理下，以Hela s3為代表的一些細(xì)胞發(fā)生了有絲分裂期阻滯（不同的細(xì)胞對(duì)于H2O2的敏感程度不同）。VK3同樣能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生與H2O2類似的作用。Aurora B激酶受到H2O2的影響較為顯著，有絲分裂時(shí)期在著絲粒上定位減弱，磷酸化水平降低等。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，與Aurora B共同組成CPC復(fù)合物的INCENP蛋白的磷酸化