Smoothened（Smo）基因在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用研究.pdf

1、背景: 胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，雖然近年來似有減少的趨勢，但其發(fā)病率仍高居各種惡性腫瘤之首。在對胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)因子的研究中，現(xiàn)已證實胃癌的發(fā)生發(fā)展與抑癌基因、癌基因、DNA修復(fù)基因、細(xì)胞粘附分子、端粒/端粒酶、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子和生長因子/受體系統(tǒng)等基因的改變有關(guān)。隨著研究的深入，與胃癌有關(guān)的癌基因及抑癌基因不斷被發(fā)現(xiàn)，這些都進(jìn)一步闡明了胃癌的發(fā)生機(jī)制，也為胃癌的治療提供新的靶向。 近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育

2、、組織分化過程中起調(diào)控作用的信號通路可能在腫瘤發(fā)生的過程中發(fā)揮著重要作用。“控制脊椎動物胚胎發(fā)育的信號通路可能與人類腫瘤的發(fā)生有關(guān)”這一觀點的提出，為腫瘤發(fā)生機(jī)制的研究提供了新的方向。 Sonic hedgehog信號通路是目前研究較為深入的在人類胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著非常重要調(diào)控作用的信號通路。現(xiàn)已證實人類皮膚基底細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、膀胱癌、髓母細(xì)胞瘤、胃癌等腫瘤的發(fā)生與sonic hedgeh

3、og信號通路異常激活密切相關(guān)。該信號通路主要由分泌型信號糖蛋白Shh配體、跨膜蛋白受體Ptch和另一跨膜蛋白Smo組成的復(fù)合物，以及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白(Gli1、Gli2、Gli3)組成。目前發(fā)現(xiàn)Sonic hedgehog信號通路異常激活存在著兩種激活方式：1)配體非依賴性激活方式：即由細(xì)胞內(nèi)的Ptch基因發(fā)生功能缺失性突變或Smo基因發(fā)生功能獲得性突變而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號通路的異常激活；2)配體依賴性激活方式：即由細(xì)胞外旁分泌的Sh

4、h配體過度表達(dá)，與細(xì)胞膜上的Ptch受體結(jié)合，從而激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路。已有研究證實胃癌組織中存在著Shh、Ptch的高表達(dá)，提示胃癌的發(fā)生與Sonic hedgehog信號通路的異常激活有關(guān)，并推測胃癌組織中Sonic hedgehog信號通路異常激活的機(jī)制可能為：配體依賴性激活方式，即由細(xì)胞外旁分泌的Shh配體過度表達(dá)，與細(xì)胞膜上的Ptch受體結(jié)合，從而激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。但是上述所推測的異常激活機(jī)制卻不能解

5、釋在Sonichedgehog信號通路中作為抑癌基因的Ptch基因何以在胃癌組織出現(xiàn)高表達(dá)這一問題。 Smo蛋白是Sonic hedgehog信號通路中的信息轉(zhuǎn)換器，它能夠把細(xì)胞外的Shh信號轉(zhuǎn)換成細(xì)胞內(nèi)的Gli1信號，從而啟動細(xì)胞核內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄，對Sonic hedgehog信號通路具有激活作用。目前已有研究證實Smo的功能獲得性突變可以誘發(fā)人類基底細(xì)胞癌的發(fā)生，在家族性和散發(fā)性基底細(xì)胞癌中Smo的突變率為20％。同樣，胃癌的

6、發(fā)生是否也與Smo基因的功能獲得性突變有關(guān)，以及胃癌發(fā)生過程中Sonic hedgehog信號通路異常激活是否存在Smo基因高表達(dá)所致的配體非依賴性激活方式，目前尚不清楚。 目的: 研究Smo基因在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，及其可能的作用機(jī)理。為進(jìn)一步明確胃癌發(fā)生發(fā)展過程中分子作用機(jī)理，以及尋找胃癌生物治療新的作用靶點提供理論依據(jù)。 方法: 1．構(gòu)建胃癌組織芯片，以正常胃粘膜組織作對照，應(yīng)用免疫組化及原位

7、雜交技術(shù)檢測Smo蛋白及Smo mRNA在胃癌組織中的表達(dá)水平，并分析胃癌組織中Smo基因表達(dá)水平與胃癌病理類型、發(fā)生部位、臨床病理分期的關(guān)系。 2．構(gòu)建胃粘膜不典型增生組織芯片，以正常胃粘膜組織作對照，應(yīng)用免疫組化及原位雜交技術(shù)檢測Smo蛋白及Smo mRNA在胃粘膜不典型增生組織中的表達(dá)水平，并分析胃粘膜不典型增生組織中Smo基因表達(dá)水平與不典型增生程度的關(guān)系。 3．應(yīng)用第一部分所構(gòu)建的胃癌組織芯片，采用免疫組化技術(shù)

8、檢測胃癌組織中Glil蛋白的表達(dá)水平，分析胃癌組織中Gli1蛋白表達(dá)水平與胃癌病理類型的關(guān)系，并結(jié)合第一部分所得出的Smo蛋白在胃癌組織中的表達(dá)結(jié)果，分析胃癌組織中Smo蛋白與下游轉(zhuǎn)錄因子Gli1蛋白表達(dá)的相關(guān)性。 4．應(yīng)用Western blot,及半定量RT-PCR技術(shù)檢測人胃癌MGC803細(xì)胞中Smo蛋白及Smo mRNA的表達(dá)水平；體外化學(xué)合成3對針對Smo mRNA的特異性小片段干擾RNA(siRNA)，利用陽性脂質(zhì)體

9、轉(zhuǎn)染方式將siRNA轉(zhuǎn)染胃癌MGC803細(xì)胞，應(yīng)用半定量RT-PCR鑒定各Smo siRNA序列干擾胃癌MGC803細(xì)胞Smo基因表達(dá)的效果，篩選出干擾胃癌MGC803細(xì)胞Smo基因表達(dá)效果最明顯的特異性siRNA；再應(yīng)用Westemblot、半定量RT-PCR及MTT法、流式細(xì)胞術(shù)檢測Smo mRNA被降解后對胃癌MGC803細(xì)胞Gli1蛋白及Gli1mRNA表達(dá)的影響，以及對胃癌MGC803細(xì)胞增殖和凋亡率的影響。 結(jié)果:

10、 1、正常胃粘膜組織中Smo蛋白的陽性表達(dá)率為32％，表達(dá)強(qiáng)度多為弱陽性，胃乳頭狀腺癌、高分化管狀腺癌、中分化管狀腺癌、低分化腺癌組織中Smo蛋白的陽性表達(dá)率分別為85.7％、77.8％、88.5％、94.4％，表達(dá)強(qiáng)度多為陽性及強(qiáng)陽性；胃粘液癌、印戒細(xì)胞癌組織中Smo蛋白的陽性表達(dá)率分別為45.5％、14.3％，表達(dá)強(qiáng)度多為弱陽性。胃乳頭狀腺癌、高分化管狀腺癌、中分化管狀腺癌、低分化腺癌組織中Smo蛋白表達(dá)顯著高于正常胃粘膜組織

11、；胃粘液癌和印戒細(xì)胞癌中Smo蛋白表達(dá)與正常胃粘膜比較無顯著性差異；另外，正常胃粘膜及胃癌組織中的Smo mRNA表達(dá)水平與Smo蛋白表達(dá)水平一致；不同臨床病理分期胃癌組織中Smo蛋白表達(dá)強(qiáng)度有顯著性差異，Ⅲ期、Ⅳ期胃癌組織中Smo蛋白表達(dá)強(qiáng)度顯著高于Ⅰ期胃癌組織，而且Smo蛋白表達(dá)強(qiáng)度有隨著胃癌臨床病理分期的增加而增加的趨勢。 2、輕度、中度、重度不典型增生胃粘膜組織中Smo蛋白陽性表達(dá)率分別為：45％、48.4％、57.1％

12、，表達(dá)強(qiáng)度多為弱陽性；胃粘膜不典型增生組織中Smo蛋白的表達(dá)有隨著不典型增生程度加重而增加的趨勢，但與正常胃粘膜比較，差異無顯著性；胃粘膜不典型增生組織中的Smo mRNA表達(dá)水平與Smo蛋白表達(dá)水平一致；胃癌組織中Smo蛋白的表達(dá)顯著高于胃粘膜不典型增生組織。 3、正常胃粘膜組織中Gli1蛋白的陽性表達(dá)率為20％，表達(dá)強(qiáng)度多為弱陽性；胃乳頭狀腺癌、高分化管狀腺癌、中分化管狀腺癌、低分化腺癌組織中Gli1蛋白的陽性表達(dá)率分別為1

13、00％、100％、96.2％、100％，表達(dá)強(qiáng)度多為陽性及強(qiáng)陽性；胃粘液癌、印戒細(xì)胞癌組織中Gli1蛋白的陽性表達(dá)率分別為36.4％、7.2％，表達(dá)強(qiáng)度多為弱陽性；胃乳頭狀腺癌、高分化管狀腺癌、中分化管狀腺癌、低分化腺癌組織中Gli1蛋白表達(dá)顯著高于正常胃粘膜組織；胃粘液癌和印戒細(xì)胞癌中Gli1蛋白表達(dá)與正常胃粘膜比較無顯著性差異；胃癌組織中Smo和IGli1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.924。 4．胃癌MGC803細(xì)胞中存

14、在Smo蛋白、Smo mRNA的強(qiáng)表達(dá)；3對針對Smo mRNA的特異性siRNA中，siRNA-1干涉作用最明顯，達(dá)61.7％，而siRNA-2干涉作用為41.2％，siRNA-3幾乎不發(fā)生任何干涉作用；篩選出siRNA-1干擾胃癌MGC803細(xì)胞Smo基因表達(dá)效果最明顯；另外，Smo基因表達(dá)被沉默后，胃癌MGC803細(xì)胞Gli1mRNA及Glil蛋白的表達(dá)均有降低，Gli1 mRNA表達(dá)降低56.2％，Gli1蛋白表達(dá)降低61.3％

15、；Smo基因表達(dá)被沉默后，胃癌MGC803細(xì)胞增殖于轉(zhuǎn)染后24小時開始顯著下降；Smo基因表達(dá)被沉默后，于轉(zhuǎn)染48h胃癌MGC803細(xì)胞細(xì)胞凋亡率為23.6％，與陽性對照組和陰性對照組比較，顯著升高。 結(jié)論: 1．胃乳頭狀腺癌、高分化管狀腺癌、中分化管狀腺癌、低分化腺癌等病理類型胃癌的發(fā)生與Smo基因有關(guān)，Smo基因的高表達(dá)可能激活某種機(jī)制而參與誘導(dǎo)該病理類型胃癌的發(fā)生，并且Smo基因表達(dá)水平的上調(diào)在推進(jìn)該病理類型胃癌的

16、病理進(jìn)展過程中發(fā)揮著作用。 2．Smo基因的高表達(dá)不是胃癌發(fā)生過程中的早期事件，而是在胃乳頭狀腺癌、高分化管狀腺癌、中分化管狀腺癌、低分化腺癌等病理類型胃癌發(fā)生過程中較晚期才出現(xiàn)的事件。 3．Smo基因高表達(dá)在胃癌發(fā)生與發(fā)展過程中的作用機(jī)理，可能是通過上調(diào)下游轉(zhuǎn)錄因子Glil蛋白的表達(dá)，異常激活Sonic hedgehog信號通路，從而誘導(dǎo)胃癌的發(fā)生與發(fā)展。 4．胃癌MGC803細(xì)胞中存在Smo基因的高表達(dá)，胃癌

17、MGC803細(xì)胞的發(fā)生可能與Sonic hedgehog信號通路的異常激活有關(guān)。 5．利用小RNA干擾技術(shù)沉默胃癌MGC803細(xì)胞Smo mRNA表達(dá)是有效可行的；胃癌MGC803細(xì)胞中Smo mRNA表達(dá)的沉默可以下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Gli1 mRNA及蛋白的表達(dá)，從而降低Sonic hedgehog信號通路的活性。 6．Smo基因與胃癌Mcc803細(xì)胞的增殖凋亡有關(guān)，它可能參與調(diào)控胃癌MGC803細(xì)胞的增殖與凋亡，Smo基因可