PLAC8在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本課題旨在檢測PLAC8在肝癌發(fā)生過程中的表達(dá)，并探討其作用機(jī)制，為HCC分子機(jī)制的探究尋找新的依據(jù)。
　　方法：
　　一、PLAC8在肝癌中的表達(dá)
　　1.肝癌病人肝臟同正常肝臟的PLAC8表達(dá)水平檢測
　　分別提取肝癌病人肝臟和正常肝臟中的RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用Real-time PCR檢測PLAC8的mRNA表達(dá)情況。
　　2.肝癌病人肝腫瘤周圍組織和腫瘤組織中PLAC

2、8的mRNA表達(dá)水平檢測
　　分別提取肝癌患者肝腫瘤周圍組織和腫瘤組織中的RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用Real-time PCR檢測PLAC8的mRNA表達(dá)情況。
　　3.肝癌病人肝腫瘤周圍組織和腫瘤組織中PLAC8的蛋白水平檢測
　　對136例肝癌病人的肝腫瘤周圍組織和腫瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測PLAC8蛋白水平的變化情況。
　　4.PLAC8水平對肝癌患者生存率的影響
　　對136例肝癌

3、患者的生存時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并對PLAC8水平的高低和生存時(shí)間作圖。
　　二、PLAC8對腫瘤生長的影響
　　Huh7細(xì)胞過表達(dá)PLAC8原位接種構(gòu)建腫瘤模型
　　將過表達(dá)PLAC8的Huh7細(xì)胞或空載體細(xì)胞以1×106/只注射至雌性BALB/c(nu/nu)小鼠肝臟中，4周后處死小鼠，取出肝臟拍照并對腫瘤體積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
　　三、PLAC8對肝腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　1.PLAC8對肝癌細(xì)胞活力的影響

4、r>　　在96孔板中接種細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)。向每孔加入10μL CCK溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4 h后用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。
　　2.PLAC8對肝腫瘤細(xì)胞克隆形成能力的影響
　　取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，分別用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，并把細(xì)胞懸浮在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，然后將細(xì)胞懸液做梯度倍數(shù)稀釋。每組細(xì)胞分別以每皿50、100、200個(gè)細(xì)胞的梯度濃度分別接種含

5、10 mL、37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動，使細(xì)胞分散均勻。置于37℃、5％ CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4％多聚甲醛固定細(xì)胞5 mL，固定15 min。然后去固定液，加入適量的GIMSA應(yīng)用染色液染色10-30 min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）計(jì)數(shù)大

6、于10個(gè)細(xì)胞的克隆倍數(shù)。
　　3.PLAC8對細(xì)胞周期的影響
　　Western blot檢測PLAC8對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Rb和CCND1蛋白水平的影響。
　　四、PLAC8抑制肝腫瘤發(fā)生的機(jī)制
　　1.PLAC8對Wnt/β-catenin信號通路的影響
　　Real-time PCR檢測PLAC8與Wnt信號通路靶基因c-Myc間的相關(guān)性;Western blot檢測Hep3B細(xì)胞中PLAC8與c-My

7、c在蛋白水平上的相互作用;熒光素酶報(bào)告分析檢測Hep3B、HepG2細(xì)胞中PLAC8對β-catenin的影響。
　　2.PLAC8對Akt/GSK3β/β-catenin信號通路的調(diào)控作用
　　Western blot檢測Hep3B、HepG2細(xì)胞中PLAC8對p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3β、β-catenin蛋白水平的影響。
　　五、肝癌發(fā)生過程中PLAC8水平下調(diào)的機(jī)制
　　1.Real-t

8、ime PCR檢測正常肝組織和肝癌組織中miR-185-5p的mRNA水平。
　　2.應(yīng)用Real-time PCR對PLAC8與miR-185-5p的mRNA水平進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　3.熒光素酶報(bào)告分析檢測Hep3B細(xì)胞中miR-185-5p對PLAC8的調(diào)控作用。
　　4.Western blot檢測Hep3B、HepG2細(xì)胞中miR-185-5p對PLAC8的調(diào)控作用。
　　5.Huh7細(xì)胞中檢測miR-

9、185-5p和PLAC8的相互作用對細(xì)胞活力的影響。
　　六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　采用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用X±s表示，Shapiro-Wilk對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)變換。兩組間計(jì)量資料差異比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)量資料多組間差異用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析，根據(jù)Levene方差齊性檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：
　　一、PLAC8在肝癌發(fā)生、

10、發(fā)展過程中表達(dá)水平降低
　　1.肝癌中PLAC8 mRNA表達(dá)水平顯著降低
　　Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，同正常肝組織相比，PLAC8的mRNA水平在肝腫瘤組織中顯著降低(p＜0.0001)。
　　2.肝腫瘤組織中PLAC8 mRNA表達(dá)水平顯著降低
　　通過對肝癌患者肝腫瘤組織和肝腫瘤周圍組織的PLAC8 mRNA水平進(jìn)行Real-time PCR檢測，結(jié)果顯示PLAC8的mRNA表達(dá)在肝腫瘤組織

11、中顯著降低(p＜0.0001)。
　　3.肝癌病人肝腫瘤組織中PLAC8的蛋白表達(dá)水平降低
　　免疫組織化學(xué)染色法結(jié)果顯示，136名肝癌患者中，有84名患者的PLAC8表達(dá)水平在肝腫瘤組織中降低，分別有26名患者的PLAC8表達(dá)水平在肝腫瘤組織中保持不變或升高。
　　4.低表達(dá)水平的PLAC8伴隨著肝癌患者存活率的降低
　　生存分析結(jié)果顯示，低表達(dá)水平PLAC8的84名患者存活率相對較低，而高表達(dá)水平PLAC8的

12、患者生存率較高(p=0.011)。
　　二、PLAC8抑制腫瘤的生長
　　通過構(gòu)建肝癌小鼠模型，結(jié)果顯示過表達(dá)PLAC8的小鼠肝腫瘤體積顯著降低(p＜0.01)。
　　三、PLAC8抑制肝腫瘤細(xì)胞活力及增殖能力
　　1.PLAC8抑制肝癌細(xì)胞的活力
　　熒光素酶報(bào)告分析結(jié)果顯示，在Huh7、SMMC-7721、HepG2、Hep3B四種肝癌細(xì)胞系中，過表達(dá)的PLAC8抑制了細(xì)胞的活力(p＜0.01);PLA

13、C8的抑制使細(xì)胞活力得到了恢復(fù)(p＜0.01)。
　　2.PLAC8抑制肝癌細(xì)胞的增殖
　　克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在Huh7、SMMC-7721肝癌細(xì)胞系中，過表達(dá)的PLAC8抑制了細(xì)胞克隆數(shù)量(p＜0.001)。
　　3.PLAC8抑制細(xì)胞周期進(jìn)程
　　Western blot檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)的PLAC8抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Rb蛋白的磷酸化，以及CCND1蛋白的表達(dá)。
　　四、PLAC8通過調(diào)控Wnt

14、/β-catenin及Akt/GSK3β/β-catenin信號通路抑制肝腫瘤的發(fā)生
　　1.PLAC8抑制Wnt/β-catenin信號通路從而抑制肝腫瘤的發(fā)生
　　Real-time PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，PLAC8與c-Myc呈負(fù)相關(guān);熒光素酶報(bào)告分析結(jié)果表明，在Hep3B和HepG2細(xì)胞中，PLAC8能調(diào)控β-catenin使其水平降低。
　　2.PLAC8抑制Akt/GSK3β/β-c

15、atenin信號通路進(jìn)而抑制肝腫瘤的發(fā)生
　　Western blot檢測結(jié)果顯示，在Hep3B和HepG2細(xì)胞中，PLAC8抑制p-Akt及β-catenin蛋白水平，促進(jìn)GSK3β蛋白的磷酸化水平。
　　五、在肝癌發(fā)生過程中，miR-185-5p抑制PLAC8的表達(dá)
　　1.肝癌中miR-185-5p水平顯著升高。
　　Real-time PCR檢測結(jié)果顯示miR-185-5p在肝腫瘤組織中顯著升高(p＜0.

16、0001)。
　　2.miR-185-5p與PLAC8 mRNA水平呈負(fù)相關(guān)
　　Real-time PCR檢測結(jié)果顯示miR-185-5p與PLAC8的mRNA水平呈負(fù)相關(guān)。
　　3.miR-185-5p抑制PLAC8水平
　　熒光素酶報(bào)告分析結(jié)果表明miR-185-5p抑制PLAC8的表達(dá);Western blot檢測結(jié)果顯示miR-185-5p下調(diào)PLAC8的蛋白表達(dá)水平。
　　4.miR-185-5

17、p抑制PLAC8進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞活力
　　miR-185-5p與PLAC8的相互作用增強(qiáng)了細(xì)胞的活力。
　　結(jié)論：
　　1.PLAC8在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，表達(dá)水平顯著降低。
　　2.PLAC8能抑制肝癌細(xì)胞的生長。
　　3.PLAC8對肝癌細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖能力以及細(xì)胞周期的進(jìn)程起到抑制作用。
　　4.PLAC8通過調(diào)控Wnt/β-catenin及Akt/GSK3β/β-catenin信號通路抑制肝