FAK信號(hào)通路在脈絡(luò)膜新生血管發(fā)生中的作用.pdf

1、研究背景:脈絡(luò)膜新生血管(choroidalneovascularization，CNV)是年齡相關(guān)性黃斑變性(agerelatedmaculardegeneration，AMD)導(dǎo)致視力喪失的最主要的原因之一，其發(fā)病機(jī)制至今尚不十分清楚。視網(wǎng)膜色素上皮(retinalpigmentepithelium，RPE)細(xì)胞可以通過調(diào)節(jié)自身多種基因的表達(dá)，對(duì)缺氧和代謝變化等周圍環(huán)境的刺激產(chǎn)生快速的應(yīng)答。在CNV發(fā)生的啟始階段，RPE細(xì)胞分泌細(xì)胞

2、因子和生長因子，促進(jìn)CNV的生成。隨后，增生的脈絡(luò)膜血管穿破Bruch膜生長至RPE和/或視網(wǎng)膜下，形成CNV。
　　CNV的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，受到生長因子和細(xì)胞黏附信號(hào)等多種因素的影響。參與調(diào)控CNV生成的RPE細(xì)胞接受多種來源的信號(hào)，如可溶性細(xì)胞因子信號(hào)和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)信號(hào)等。黏著斑激酶(focaladhesionkinase，F(xiàn)AK)，一種非受體型酪氨酸激酶，在細(xì)胞骨架和整合素/

3、細(xì)胞因子受體信號(hào)的鏈接中發(fā)揮重要的作用，并參與調(diào)控細(xì)胞增生、存活、移行和分化等細(xì)胞進(jìn)程。ECM和可溶性細(xì)胞因子均可活化FAK。進(jìn)來的研究還表明，F(xiàn)AK參與了新生血管的應(yīng)答，并且在病理性視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。然而，F(xiàn)AK在CNV發(fā)生中的作用尚未見相關(guān)報(bào)道。
　　目的和內(nèi)容:探討FAK在CNV發(fā)生中的作用，進(jìn)一步闡明CNV的發(fā)生機(jī)制。在建立激光誘導(dǎo)的大鼠CNV模型基礎(chǔ)上，觀察FAK的表達(dá)與CNV生成的相關(guān)性；體外觀察

4、多種已知與CNV生成相關(guān)的危險(xiǎn)因素的作用下，培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞中FAK的表達(dá)；運(yùn)用小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)特異性抑制RPE細(xì)胞FAK的表達(dá)，觀察FAK信號(hào)通路在CNV發(fā)生中的作用。
　　方法:⑴激光擊穿Bruch膜，建立挪威(BrownNorway，BN)大鼠CNV模型。分別于激光光凝后1、3、7和14天，免疫熒光和Westernblot方法觀察大鼠CNV中FAK的表達(dá)；⑵體外原代培養(yǎng)人R

5、PE細(xì)胞，分別暴露于缺氧、H2O2氧化衰老、ECM成分和吞噬光感受器外節(jié)膜盤(outsegmentofphotoreceptors，POS)等刺激因素。Westernblot方法觀察RPE細(xì)胞中FAK的表達(dá)；⑶運(yùn)用siRNA技術(shù)特異性抑制RPE細(xì)胞FAK的表達(dá)，RT-PCR、Westernblot和ELISA等方法觀察缺氧條件下RPE細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α)和血管內(nèi)皮生長

6、因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)的表達(dá)；⑷原代培養(yǎng)牛脈絡(luò)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(choroidalendothelialcells，CEC)，建立RPE-CEC共培養(yǎng)體系。采用MTT和結(jié)晶紫染色等方法觀察特異性抑制FAK表達(dá)的RPE細(xì)胞對(duì)CEC增生和移行的影響。
　　結(jié)果:⑴在激光誘導(dǎo)的BN大鼠CNV生成早期(光凝后1d、3d)，RPE-脈絡(luò)膜復(fù)合體中FAK表達(dá)顯著升高，隨后表達(dá)逐漸下降。

7、免疫熒光檢測(cè)顯示，F(xiàn)AK的表達(dá)上調(diào)主要定位于參與CNV生成的RPE細(xì)胞中；⑵體外實(shí)驗(yàn)表明，目前已知的多種與CNV生成相關(guān)的影響因素，如缺氧、氧化衰老、POS代謝產(chǎn)物在胞內(nèi)堆積以及Bruch膜破裂導(dǎo)致的RPE與ECM成分的接觸等，均可不同程度上調(diào)RPE細(xì)胞內(nèi)FAK的表達(dá)；⑶成功構(gòu)建了pSilencer/FAK表達(dá)載體，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染RPE細(xì)胞可有效下調(diào)FAK的表達(dá)。運(yùn)用siRNA特異性抑制RPE細(xì)胞FAK的表達(dá)后，可以顯著抑制缺氧誘導(dǎo)

8、的RPE細(xì)胞HIF-1α和VEGF的表達(dá)上調(diào)；⑷成功原代培養(yǎng)牛CEC細(xì)胞，利用細(xì)胞共培養(yǎng)體系觀察到RPE細(xì)胞與CEC共培養(yǎng)可以刺激CEC的增生和移行，缺氧條件下刺激作用增強(qiáng)。而運(yùn)用siRNA特異性抑制RPE細(xì)胞FAK的表達(dá)后，可以顯著抑制缺氧條件下RPE細(xì)胞對(duì)CEC增生和移行的誘導(dǎo)作用。
　　結(jié)論:本研究首次證實(shí)FAK信號(hào)參與了激光誘導(dǎo)的大鼠CNV的生成，提示CNV發(fā)生早期，活化的RPE細(xì)胞內(nèi)FAK表達(dá)的上調(diào)參與CNV生成的調(diào)控。

9、體外實(shí)驗(yàn)表明，多種已知與CNV生成相關(guān)的刺激因素均可不同程度上調(diào)RPE細(xì)胞FAK的表達(dá)，進(jìn)一步提示FAK在CNV發(fā)生過程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。特異性抑制RPE細(xì)胞FAK的表達(dá)，可以顯著抑制缺氧誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞HIF-1α和VEGF的表達(dá)上調(diào)，并進(jìn)而抑制CEC增生和移行，進(jìn)一步明確了FAK對(duì)CNV生成的調(diào)控作用。綜上，F(xiàn)AK信號(hào)參與了CNV生成過程的調(diào)控，此類研究在國內(nèi)外尚未見報(bào)道。針對(duì)FAK的siRNA可以抑制CNV生成，這將為臨床防