骨髓來源細胞在脈絡(luò)膜新生血管發(fā)生發(fā)展中的作用及其治療潛能.pdf

1、研究背景：脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)是近40種眼病的共有體征,視網(wǎng)膜下病理性新生血管的生長不但損傷正常脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu),而且常發(fā)生出血滲漏,往往造成嚴重視力損害。CNV的發(fā)生機制復(fù)雜,涉及多種細胞、因子和信號通路,確切機制尚未完全闡明。成年個體新生血管的形成包含兩種機制:血管生成(angiogenesis)指原有的血管細胞發(fā)生增生、移行,形成新的血管;血管發(fā)生(vasculoge

2、nesis)指由干細胞分化而來的血管細胞構(gòu)成新血管。干細胞在一般情況下處于“休眠”狀態(tài),在外因刺激或病理狀態(tài)下會進入血液循環(huán),移行至周邊組織,表現(xiàn)出不同程度的更新和分化能力,參與組織修復(fù)和新生物形成。近期的研究表明,CNV的生成兼具這兩種方式,既有原位組織細胞的增殖,又有骨髓來源細胞(bone marrow-derived cells, BMCs)的參與,但BMCs究竟以何種方式參與CNV生成、BMCs對CNV發(fā)展有何影響有待進一步闡明

3、。此外,BMCs是一個異質(zhì)性細胞群體,包含多種干/祖細胞,究竟是哪種干/祖細胞參與了CNV的生成、它們在CNV發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著怎樣的作用、是否可作為CNV治療的靶點等諸多問題有待研究。
　　目的和內(nèi)容：探討B(tài)MCs在CNV發(fā)生發(fā)展中的作用,在危險因素影響CNV發(fā)展中的介導(dǎo)作用,及作為干細胞療法細胞載體的潛能。
　?、沤57-綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)嵌合體小鼠,觀察在嵌合

4、體CNV發(fā)生發(fā)展過程中,BMCs在CNV聚集、分化和表達蛋白情況;
　?、铺接懩峁哦⑴cCNV生成的BMCs的趨化、分化和蛋白表達能力的影響;
　?、怯^察骨髓來源基質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向CNV的趨化特異性和時間窗,觀察MSCs參與CNV生成情況,探討MSCs是否具備作為藥物載體的潛能;
　?、葮?gòu)建表達人源性色素上皮衍生因子(pigment epithelium deri

5、ved factor, PEDF)的腺病毒,觀察腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSCs對CNV的抑制作用,探討利用MSCs靶向治療CNV的新策略。
　　方法：⑴通過GFP轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型C57小鼠的骨髓移植建立嵌合體小鼠,利用532nm激光建立小鼠CNV模型,脈絡(luò)膜鋪片觀察GFP-BMCs向CNV趨化、參與血管結(jié)構(gòu)組成的情況,免疫熒光染色觀察CNV中BMCs分化的細胞類型(包括血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞和巨噬細胞)及表達血管內(nèi)皮生長因子(vas

6、cular endothelial growth factor, VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast cell growth factor, bFGF)的情況;
　?、萍す夤饽57-GFP嵌合體小鼠CNV模型后,即日在其飲水中添加尼古丁(100μg/ml),對照組嵌合體小鼠建立CNV模型后普通飼養(yǎng),4周后眼球切片HE染色觀察CNV厚度與直徑,脈絡(luò)膜鋪片觀察CNV表面積、GFP-BMCs的趨化

7、和參與構(gòu)成血管情況,免疫熒光染色觀察CNV中BMCs分化情況及各因子表達變化;
　?、求w外培養(yǎng)GFP轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓來源MSCs,野生型小鼠激光建模后0.5-1小時尾靜脈注射4.0×106 GFP-BMCs或GFP-MSCs,激光后1、3、7天,心、肝、脾、肺、心臟切片熒光觀察比較兩種細胞在器官內(nèi)的滯留情況;野生型小鼠激光后0.5-1小時、3天及6天,分別注射4.0×106 GFP-MSCs,激光后7天觀察比較單次注射、雙次注射和三

8、次注射后GFP-MSCs在體內(nèi)移行和向CNV趨化的情況;酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)和免疫熒光染色檢測激光后不同時間眼內(nèi)干細胞趨化因子基質(zhì)細胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1, SDF-1)的表達;脈絡(luò)膜鋪片檢測參與構(gòu)成新血管的GFP-MSCs,免疫熒光染色分析CNV中GFP-MSCs分化的細胞類型;
　?、葮?gòu)建表達人源

9、性PEDF、含報告基因GFP、E1 E3缺陷的5型腺病毒(adenovirus, Ad),轉(zhuǎn)導(dǎo)體外培養(yǎng)的野生型小鼠骨髓來源MSCs,倒置熒光顯微鏡觀察及流式細胞儀測定感染效率,ELISA檢測體外人源性PEDF表達情況;激光后0.5-1小時小鼠尾靜脈分別注射4.0×106 Ad-PEDF/MSCs、對照病毒Ad-GFP/MSCs、GFP-MSCs及0.4ml磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline, PBS),分別

10、于激光后1、3、5、7天利用免疫熒光染色和ELISA檢測眼內(nèi)人源性PEDF表達,激光后7天眼球切片組織學分析和脈絡(luò)膜鋪片分析比較各組CNV厚度、直徑及表面積。體外建立視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)細胞與MSCs的共培養(yǎng)體系,分析MSCs分泌的PEDF對RPE細胞增生和移行的影響。
　　結(jié)果：⑴激光后大量GFP-BMCs聚集于激光斑處并整合入CNV中的血管結(jié)構(gòu)內(nèi),由其組成的血管面積約

11、占CNV表面積的16.22％。GFP-BMCs主要分布于CNV區(qū)域(包括CNV深層的脈絡(luò)膜),少量散布于CNV表層的視網(wǎng)膜、角鞏膜緣、睫狀體、視盤周圍及遠離CNV的視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜和鞏膜。CD31或αSMA陽性的GFP+細胞僅出現(xiàn)于CNV區(qū)域,F4/80+/GFP+細胞不僅出現(xiàn)在CNV區(qū)域,還出現(xiàn)在CNV表層的視網(wǎng)膜、角鞏膜緣和睫狀體內(nèi)。CNV內(nèi)CD31/GFP、αSMA/GFP和F4/80/GFP雙陽性細胞在全部GFP+細胞中的構(gòu)成比隨

12、CNV進展而變化,CD31/GFP或F4/80/GFP雙陽性細胞構(gòu)成比的最高值出現(xiàn)于激光后第2周,而αSMA+/GFP+細胞構(gòu)成比在激光后4周仍處上升趨勢。CNV區(qū)域的一些GFP-BMCs可表達促血管形成因子VEGF和bFGF。
　?、颇峁哦√幚斫M小鼠CNV長度和表面積增大,CNV內(nèi)GFP-BMCs的面積和密度增加,GFP-BMCs來源的血管細胞面積增加,F4/80+/GFP+細胞構(gòu)成比下降,CNV內(nèi)VEGF和bFGF的表達及CN

13、V下脈絡(luò)膜內(nèi)VCAM-1的表達上調(diào)。
　　⑶在整個觀察期間,肺、肝和脾內(nèi)可見GFP+BMCs滯留,但未觀測到GFP+MSCs。單次、雙次或三次MSCs注射后趨化至CNV的MSCs的數(shù)量沒有明顯差異,雙次和三次注射組小鼠的脾內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量GFP-MSCs。SDF-1免疫熒光染色顯示,激光后初期,SDF-1在激光斑處RPE層表達,隨著CNV生成,CNV內(nèi)出現(xiàn)陽性染色;ELISA結(jié)果顯示,SDF-1表達水平在最初24小時內(nèi)迅速增加,在第2天

14、時達頂峰,然后迅速下降。MSCs移植后外周血和骨髓的流式分析顯示,MSCs僅于第1天內(nèi)在骨髓中作短暫停留。脈絡(luò)膜鋪片顯示,激光后第1天,GFP-MSCs散布于激光斑周圍;第3天時,GFP-MSCs組成的“細胞環(huán)”圍繞激光斑,顯示出向CNV靠近的定向移行趨勢;第7天,GFP-MSCs進入CNV內(nèi)并加入血管組成中。眼球切片顯示絕大多數(shù)GFP-MSCs位于激光斑處脈絡(luò)膜與光感受器間的CNV內(nèi)。在這些MSCs中發(fā)現(xiàn)了血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞

15、、巨噬細胞、上皮細胞和成纖維細胞的標記物(CD31,αSMA, F4/80, keratin,和vimentin)的陽性表達。
　?、華d轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠MSCs后24小時,倒置熒光顯微鏡檢測到報告基因GFP的表達,流式分析顯示(73.6±5.3)％的細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)成功,AdPEDF轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSCs在體外表達PEDF可持續(xù)至少8天。AdPEDF組小鼠的眼球切片中,人PEDF的陽性染色出現(xiàn)于MSCs內(nèi)及其周圍的細胞外基質(zhì)中;ELISA結(jié)果顯示,在整

16、個觀察期間,眼內(nèi)人PEDF呈穩(wěn)定表達,表達量是抑制CNV閾值的4倍多;其CNV的厚度、長度和表面積明顯減小。與AdPEDF/MSCs共培養(yǎng)的RPE細胞較之其他共培養(yǎng)條件下的RPE細胞增生和移行更快。
　　結(jié)論：⑴BMCs分化為多種細胞類型參與CNV細胞構(gòu)成,分泌促血管形成因子促進CNV發(fā)展,在CNV生成過程中發(fā)揮著重要作用。CNV微環(huán)境趨化BMCs,并支持和調(diào)控BMCs的分化方向。BMCs與CNV微環(huán)境可能存在相互作用。
　

17、　⑵尼古丁促進BMCs向CNV趨化和參與CNV生成,并影響CNV內(nèi)BMCs的分化。尼古丁對BMCs的這種作用可能部分通過調(diào)節(jié)局部因子(如VEGF、VCAM-1)表達實現(xiàn)。
　?、荕SCs僅出現(xiàn)于CNV而不在其他器官停留(骨髓中一過性停留),提示其在CNV模型中具有比BMCs更為卓越的特異趨化能力;一次激光光凝引起的MSCs趨化具有有限的時間窗,其原因可能是激光后CNV區(qū)域趨化因子的表達規(guī)律。激光后MSCs逐步趨化至CNV內(nèi),并分化