Dll4-Notch信號(hào)通路在脈絡(luò)膜新生血管生成中的作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　脈絡(luò)膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV），包括血管發(fā)生和血管生成過(guò)程，是多種可造成嚴(yán)重不可逆視力喪失的視網(wǎng)膜疾病的共同病理基礎(chǔ)。在近幾十年的努力中，對(duì)于CNV的病理生理機(jī)制和防治策略的研究已經(jīng)取得了不少成績(jī)。然而，CNV的發(fā)展是一個(gè)非常復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程。對(duì)于其發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制仍然知之甚少。
　　Delta樣配體4（Delta-like ligand 4，Dll4）是N

2、otch信號(hào)系統(tǒng)家族在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的配體之一，特異性的表達(dá)于生理性和病理性的血管系。值得注意的是，小鼠基因敲除的研究中發(fā)現(xiàn)，單一Dll4等位基因缺失便會(huì)由于血管系統(tǒng)的發(fā)育障礙而導(dǎo)致小鼠胚胎期死亡。到目前為止，已知的僅有兩個(gè)血管發(fā)育相關(guān)基因，Dll4和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），具有半劑量等位基因致死效應(yīng)，表明其在血管發(fā)生及生成過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。
　　以往

3、的研究中發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1）對(duì)于調(diào)控視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細(xì)胞的功能非常重要，參與RPE細(xì)胞在受到多種來(lái)自于視網(wǎng)膜、Bruch’s膜及脈絡(luò)膜毛細(xì)血管微環(huán)境中如缺氧等刺激因素的影響后誘導(dǎo)CNV發(fā)生的起始過(guò)程。缺氧環(huán)境下，RPE細(xì)胞可通過(guò)HIF-1α-VEGF通路信號(hào)介導(dǎo)，影響脈絡(luò)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（choroidal

4、microvascular endothelial cells，CECs）的功能，從而調(diào)控CNV的發(fā)生發(fā)展。而已有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，Dll4屬于缺氧調(diào)控基因，在內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）功能中，它不僅可以直接受到HIF-1的信號(hào)誘導(dǎo)，同時(shí)也可接受HIF-1-VEGF通路信號(hào)調(diào)節(jié)。
　　結(jié)合這些研究結(jié)果，我們推測(cè)，在視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜疾病的病理變化中，Dll4/Notch信號(hào)可能參與HIF-1α-VEGF信號(hào)途徑調(diào)

5、節(jié)CNV的血管生成。并且，我們課題組的研究已首次證實(shí)，Notch信號(hào)參與到CNV的調(diào)控，其信號(hào)的缺失將導(dǎo)致小鼠的激光誘導(dǎo)CNV模型發(fā)生更為嚴(yán)重的新生血管生成。然而，對(duì)于Dll4/Notch信號(hào)在CNV中調(diào)控作用的具體機(jī)制目前還尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　目的：
　　本研究擬觀察環(huán)境缺氧刺激下Dll4在眼內(nèi)細(xì)胞的表達(dá)情況，探討Dll4在參與調(diào)控CNV生成過(guò)程中與HIF-1α-VEGF信號(hào)通路間的關(guān)系，并應(yīng)用共培養(yǎng)體系，模擬體內(nèi)環(huán)境狀態(tài)下

6、RPE細(xì)胞與CECs之間的關(guān)系，以觀察Dll4在缺氧條件下RPE細(xì)胞誘導(dǎo)CECs功能變化過(guò)程中發(fā)揮的具體作用。
　　方法：
　　1．在本研究中，為了便于實(shí)驗(yàn)操作及相關(guān)研究，我們選擇了與人CECs高度同源的恒河猴脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞系——RF/6A細(xì)胞用來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。對(duì)于體外培養(yǎng)的RF/6A細(xì)胞和RPE細(xì)胞進(jìn)行CoCl2誘導(dǎo)的化學(xué)缺氧刺激，并建立RPE-RF/6A接觸/非接觸共培養(yǎng)體系以探討Dll4參與HIF-1α-V

7、EGF通路途徑影響CNV調(diào)控的具體作用。
　　2．應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting方法，分析Dll4、VEGF以及HIF-1α在缺氧的RF/6A細(xì)胞中的表達(dá)變化。通過(guò)shRNA干擾、免疫熒光染色法分析幾個(gè)因子之間的相互作用關(guān)系。對(duì)RF/6A細(xì)胞進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染，通過(guò)轉(zhuǎn)染表達(dá)全長(zhǎng)Dll4的質(zhì)?；虬邢駾ll4的siRNA形成Dll4不同表達(dá)水平的內(nèi)皮細(xì)胞系。此外，應(yīng)用Notch通路抑制劑γ分泌酶抑制劑（gamma se

8、cretase inhibitor，GSI）阻斷整個(gè)Notch通路信號(hào)。然后用不同Dll4/Notch通路信號(hào)水平的RF/6A細(xì)胞與RPE細(xì)胞在缺氧條件下共培養(yǎng)，觀察由RPE誘導(dǎo)的RF/6A細(xì)胞功能改變情況。
　　3．另外，通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)了Dll4在RPE細(xì)胞中的表達(dá)，并利用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting檢測(cè)方法，分析了RPE細(xì)胞中Dll4在化學(xué)缺氧刺激下的表達(dá)變化。同時(shí)，通過(guò)體外轉(zhuǎn)染技術(shù)改變RPE細(xì)胞中的

9、Dll4表達(dá)水平，觀察其對(duì)RPE細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等功能的影響。
　　結(jié)果：
　　1．研究顯示RF/6A細(xì)胞中Dll4的mRNA和蛋白表達(dá)水平在CoCl2誘導(dǎo)的化學(xué)缺氧條件下顯著上調(diào)，呈時(shí)間依賴性改變，并且這種上調(diào)變化受到HIF-1α以及VEGF的信號(hào)介導(dǎo)。共培養(yǎng)體系的結(jié)果表明，在缺氧的RPE細(xì)胞誘導(dǎo)條件下，提高RF/6A的Dll4表達(dá)水平使得細(xì)胞增殖能力和血管形成能力增強(qiáng)，但侵襲能力減弱。siRNA抑制細(xì)胞中Dll4的表

10、達(dá)后則使細(xì)胞功能呈現(xiàn)相反的改變。藥物性阻斷劑GSI完全阻斷Notch通路信號(hào)后對(duì)RF/6A細(xì)胞功能產(chǎn)生的作用與單純抑制Dll4的作用一致，但不完全相同。接觸共培養(yǎng)體系中觀察到Dll4具有抑制RF/6A細(xì)胞穿透RPE細(xì)胞單層的作用。此外，我們還發(fā)現(xiàn)VEGFR1、VEGFR2、EphrinB2和EphB4，幾個(gè)關(guān)鍵的CNV調(diào)控相關(guān)因子，在組成性過(guò)表達(dá)Dll4的RF/6A細(xì)胞中表達(dá)發(fā)生顯著性改變，為RF/6A細(xì)胞行為學(xué)的變化提供了機(jī)制分析。<

11、br>　　2．另外，對(duì)于Dll4在RPE細(xì)胞中的初步研究發(fā)現(xiàn)：RPE細(xì)胞中存在Dll4的表達(dá)，缺氧誘導(dǎo)刺激下，RPE細(xì)胞中Dll4的mRNA和蛋白表達(dá)增加呈時(shí)間依賴性改變。應(yīng)用體外轉(zhuǎn)染技術(shù)改變RPE細(xì)胞中Dll4的表達(dá)水平以及藥物性阻斷Notch通路信號(hào)后發(fā)現(xiàn)，Dll4對(duì)RPE細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，但對(duì)移行和侵襲呈現(xiàn)抑制作用。此外，接觸RPE-RF/6A共培養(yǎng)體系中觀察到，在RPE細(xì)胞中組成性過(guò)表達(dá)Dll4將阻礙RF/6A細(xì)胞穿過(guò)RP