ERK-NF-κB-VEGF信號(hào)通路在GMCSF調(diào)控創(chuàng)傷愈合血管新生中的作用.pdf

1、目的：創(chuàng)傷愈合包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和組織重建三個(gè)互相重疊但又具有不同特點(diǎn)的階段。其中炎癥反應(yīng)是啟動(dòng)創(chuàng)傷愈合并貫穿于整個(gè)過(guò)程的關(guān)鍵，增殖期則是通過(guò)上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移來(lái)實(shí)施創(chuàng)傷的修復(fù)。創(chuàng)傷愈合中的新生血管化由創(chuàng)傷后的炎癥介質(zhì)啟動(dòng)編碼的促血管生成因子作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移而完成，它為創(chuàng)傷部位提供氧、營(yíng)養(yǎng)和生物活性物質(zhì)，因此對(duì)創(chuàng)傷愈合起到了重要作用。課題組在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中觀察到GMCSF基因剔除小鼠創(chuàng)傷后新生血

2、管的生成減少；在野生型小鼠和新西蘭兔的創(chuàng)傷模型中發(fā)現(xiàn)GMCSF、VEGF與新生血管的形成存在時(shí)相性關(guān)系；體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了GMCSF通過(guò)激活NF-κB誘導(dǎo)VEGF的蛋白質(zhì)合成；在前期試驗(yàn)也已驗(yàn)證了GMCSF具有活化NF-κB來(lái)誘導(dǎo)VEGF在成纖維細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成的作用，本課題將在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步篩選和探討GMCSF下游和NF-k B上游間的信號(hào)通路，以期闡明GMCSF調(diào)控創(chuàng)傷愈合中血管新生的分子信號(hào)機(jī)制。此研究對(duì)闡明

3、創(chuàng)傷愈合中新生血管化的細(xì)胞和分子生物學(xué)機(jī)制具有重要的理論創(chuàng)新意義。
　　 方法：⑴體外分離培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞，應(yīng)用含不同濃度GMCSF的培養(yǎng)液，孵育離體培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞，作用不同時(shí)間后，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）) 、蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)分別檢測(cè)人皮膚成纖維細(xì)胞VEGFmRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)。⑵篩選出合適濃度的信號(hào)特異性抑制劑預(yù)處理成纖維細(xì)胞，然后再用GMC

4、SF刺激已預(yù)處理過(guò)的細(xì)胞，收集細(xì)胞和上清液，采用ELISA的方法或Western blot檢測(cè)VEGF的含量的變化。如VEGF含量降低，提示該抑制的通路可能參與介導(dǎo)GMCSF受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，然后采用siRNA技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測(cè)該信號(hào)通路的磷酸化水平來(lái)驗(yàn)證該信號(hào)。⑶檢測(cè)該通路是否為介導(dǎo)GMCSF活化NF-κB的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。采用研究⑵證實(shí)的信號(hào)通路抑制劑處理成纖維細(xì)胞后，再應(yīng)用GMCSF處理細(xì)胞，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)N

5、F-κB的活化情況來(lái)證實(shí)該信號(hào)是否參與了GMCSF活化NF-κB的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。除此外，采用凝膠電泳遷移技術(shù)（EMSA）對(duì)NF-κB的激活進(jìn)行分析，以驗(yàn)證該信號(hào)是否參與了GMCSF活化NF-κB的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。⑷體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證GMCSF-ERK-NF-κB-VEGF信號(hào)通路在調(diào)控血管新生中的作用:收集方法⑵中的成纖維細(xì)胞上清液，處理有劃痕的血管內(nèi)皮細(xì)胞及培養(yǎng)在細(xì)胞外基質(zhì)上的血管內(nèi)皮細(xì)胞，分析其遷移及管腔形成率的變化。
　　 結(jié)果：①與空白

6、組比較，隨著GMCSF濃度的增加VEGF表達(dá)量也逐步增加，以50 -100 ng/ml濃度最為顯著（P<0.01）；應(yīng)用50ng/ml的GMCSF作用人皮膚成纖維細(xì)胞0、2、4、6、8、12 h后，VEGFmRNA水平于2h開(kāi)始升高，到4-6h達(dá)到峰值，后逐步降低（表達(dá)均較對(duì)照組顯著增強(qiáng),p<0．05)。Western blot檢測(cè)示：GMCSF作用12h及24h后，與空白組比較VEGF表達(dá)明顯增加，以24h為顯著（P<0.05）。EL

7、ISA檢測(cè)結(jié)果也顯示：與空白組比較，GMCSF作用組VEGF蛋白分泌量顯著增加（P<0.05），并具有一定的時(shí)間依賴性。②PD98059能顯著抑制GMCSF誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞VEGF蛋白水平表達(dá)的作用，而SB203580、SP600125對(duì)GMCSF誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白水平的表達(dá)無(wú)顯著差異（P>0.05）；通過(guò)SiRNA干擾ERK信號(hào)通路后，與陰性對(duì)照比較，轉(zhuǎn)染ERK組其VEGF蛋白表達(dá)顯著減少（P<0.05），而陰性組

8、與空白組之間比較，VEGF表達(dá)無(wú)顯著差異（P>0.05）。另外，GMCSF能夠顯著活化ERK磷酸化過(guò)程。③通過(guò)應(yīng)用PD98059抑制ERK信號(hào)通路后，免疫熒光顯示：與GMCSF組比較，PD98059+GMCSF組處理的成纖維細(xì)胞其NF-κB活化顯著被抑制；另外我們通過(guò)EMSA技術(shù)也證實(shí)，抑制ERK 信號(hào)通路后，NF-κB的活化被顯著抑制。④體外血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)顯示，與空白組比較，GMCSF能顯著促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移（P<0.05）

9、；而抑制ERK通路或NF-κB后，遷移距離顯著縮短（P<0.05）。體外管腔形成實(shí)驗(yàn)顯示，與空白組比較，GMCSF能顯著促進(jìn)管腔的形成；而抑制ERK通路或NF-κB后，管腔結(jié)構(gòu)顯著減少（P<0.05）。
　　 結(jié)論：⑴GMCSF能夠顯著誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞VEGF的表達(dá)，且具有劑量及時(shí)間依賴性；⑵GMCSF可經(jīng)ERK信號(hào)通路調(diào)控VEGF在成纖維細(xì)胞中的表達(dá)；⑶GMCSF可經(jīng)ERK信號(hào)通路活化NF-κB誘導(dǎo)VEGF在成纖維細(xì)胞中表