MMPs在鈣網(wǎng)蛋白缺陷細(xì)胞創(chuàng)傷愈合中的作用研究.pdf

1、背景：
　　難愈性傷口嚴(yán)重影響了病人的生理健康和生活質(zhì)量,盡管已有的分子水平的治療方法為解決此難題提供了很多有效的方法,但并未達(dá)到預(yù)期效果。因此研究促進(jìn)傷口愈合的組織因子,具有重要的臨床治療意義。傷口愈合是一個(gè)多細(xì)胞、細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)參與的過(guò)程,它受機(jī)體多種因素緊密調(diào)控。
　　創(chuàng)傷的愈合依賴于機(jī)體對(duì)損傷組織的清除,及促進(jìn)新細(xì)胞增殖、遷移至創(chuàng)傷部位,并對(duì)新形成的組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行重新排列和組合,以恢復(fù)組織的功能。在這個(gè)過(guò)程中,細(xì)

2、胞外基質(zhì)重塑是至關(guān)重要的。損傷組織的清除與細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)的重塑受基質(zhì)金屬蛋白酶的調(diào)節(jié)。MMPs(Matrix metalloproteinases,MMPs)是一類活性依賴于鋅離子(Zn2+)的內(nèi)源性蛋白水解酶家族,幾乎可降解除多糖外的全部ECM成分。因?yàn)镸MPs的降解功能,它們可以直接或間接地影響細(xì)胞因子及趨化因子活性,從而發(fā)揮調(diào)節(jié)損傷修復(fù)的的作用。基質(zhì)金屬蛋白酶中的明膠酶,可以降解基膜

3、中的主要成分,如變性的膠原蛋白和IV型膠原蛋白,因此它的作用是不可缺少的。
　　鈣網(wǎng)蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中主要的Ca2+結(jié)合分子伴侶,參與多種生理和病理過(guò)程。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)鈣網(wǎng)蛋白一個(gè)重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外功能有促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的作用,目前對(duì)于CRT促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的機(jī)制尚未闡明。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)CRT基因敲除能使小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的MMP2/MMP9表達(dá)活性發(fā)生改變,同時(shí)出現(xiàn)JNK的活化增強(qiáng)?；谇捌谘芯?我們猜測(cè)在創(chuàng)傷修復(fù)的過(guò)程中,CRT可能通過(guò)

4、JNK信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)節(jié)MMPs活性的作用。為此,我們通過(guò)體外培養(yǎng)細(xì)胞模型,探討CRT促進(jìn)細(xì)胞創(chuàng)傷愈合的通路及分子機(jī)制,為CRT用于治療慢性遷延不愈的創(chuàng)傷提供更多的理論依據(jù)。
　　目的：
　　體外培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Mouse embryonic fibroblast cells,MEF)野生株(wide type,wt)和鈣網(wǎng)蛋白基因敲除株(calreticulin null,crt),探討CRT對(duì)細(xì)胞創(chuàng)傷愈合的影響,并

5、進(jìn)一步了解CRT是否通過(guò)JNK信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)節(jié)MMPs活性的作用。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)wt及crt-/-小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、絲裂霉素C(Mitomycin C,MMC)組、MMC+JNK抑制劑組(SP600125),采用細(xì)胞劃痕的方法,人為地給wt及crt-/-細(xì)胞造成損傷,按0h,8h,12h,24h取樣,拍照,觀察細(xì)胞增殖遷徙,創(chuàng)傷愈合情況。同時(shí)利用明膠酶譜法從蛋白活性上觀察三組細(xì)胞MMP2和MMP9

6、的活性改變。
　　結(jié)果：
　　1.JNK抑制劑對(duì)創(chuàng)傷愈合的影響
　　對(duì)wt、crt-/-細(xì)胞進(jìn)行劃痕處理,按0h,8h,12h,24h取樣,拍照,觀察到crt-/-細(xì)胞的增殖遷徙能力較wt細(xì)胞強(qiáng);予MMC(10umol/L)處理3小時(shí)抑制wt、crt-/-細(xì)胞的增殖,隨后加入JNK抑制劑(10umol/L),發(fā)現(xiàn)JNK抑制劑對(duì)兩種細(xì)胞均有抑制遷徙的能力,而crt-/-細(xì)胞的遷徙能力仍較wt細(xì)胞的強(qiáng);
　　2.細(xì)胞

7、劃痕對(duì)MMP9和MMP2活性的影響
　　給予細(xì)胞劃痕處理24小時(shí)后,wt細(xì)胞、crt-/-細(xì)胞的MMP9、MMP2活性均未見(jiàn)明顯改變。
　　3.JNK抑制劑對(duì)MMP9和MMP2活性的影響
　　給予JNK抑制劑(10umol/L)處理24小時(shí)后,crt-/-細(xì)胞的MMP9活性較對(duì)照組明顯升高(P<0.001),而MMP2活性較對(duì)照組明顯下降(P<0.001);wt細(xì)胞的MMP2及MMP9活性較對(duì)照組改變不明顯。