真皮多能干細(xì)胞參與創(chuàng)傷愈合機(jī)制的實驗研究.pdf

1、干細(xì)胞是指未成熟細(xì)胞，具有自我更新和分化能力，在一定的誘導(dǎo)條件下，可以分化為其他細(xì)胞、組織及器官。干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell，ES細(xì)胞)和成體干細(xì)胞(Adultstemcells)，它們在細(xì)胞療法、基因治療、發(fā)育學(xué)研究、藥理及毒理學(xué)等研究中已顯示出無可比擬的作用和優(yōu)越性。成體干細(xì)胞是存在于發(fā)育成熟個體組織中的可自我更新和分化為原組織所有細(xì)胞類型的未分化細(xì)胞[4]。其中存在于骨髓基質(zhì)中的間充質(zhì)干細(xì)胞(mes

2、enchymalstemcells)是研究最早和最為深入的一類多能干細(xì)胞，其來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，具有廣泛的分化潛能，并已經(jīng)在多種疾病和損傷的試驗性治療中顯示出良好前景。 我們在前期成體干細(xì)胞研究基礎(chǔ)上，成功分離大鼠真皮多能干細(xì)胞(dermalMultipotentStemCellsdMSCs)，初步研究提示真皮多能干細(xì)胞是一種重要的參與創(chuàng)傷修復(fù)啟動的組織修復(fù)細(xì)胞。為了深入研究真皮多能干細(xì)胞參與創(chuàng)傷修復(fù)啟動的分子機(jī)制，

3、屈紀(jì)富等構(gòu)建了傷口液作用前后真皮多能干細(xì)胞差異表達(dá)cDNA文庫，為進(jìn)一步篩選、克隆與真皮多能干細(xì)胞參與創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)的差異表達(dá)基因奠定了基礎(chǔ)。 本實驗首先對真皮多能干細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)和鑒定；接著觀察了真皮多能干細(xì)胞對傷后不同時相傷口液的反應(yīng)性變化，以探討真皮多能干細(xì)胞在創(chuàng)傷愈合中的意義；然后通過菌液PCR擴(kuò)增抑制消減雜交文庫中485個克隆的插入片斷，制作基因芯片對文庫中的克隆進(jìn)行反向鑒定，對陽性克隆測序并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，再通

4、過體外實驗(創(chuàng)傷早期傷口液作用真皮多能干細(xì)胞前后相應(yīng)基因或蛋白的表達(dá)變化)和整體實驗(觀察正常大鼠皮膚和創(chuàng)傷后大鼠傷口皮膚組織表達(dá)相應(yīng)基因或蛋白的變化)兩個方面觀察所篩選的基因表達(dá)變化，以初步驗證這些差異表達(dá)基因在創(chuàng)傷愈合中的意義；最后，我們選擇分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制因子(SecretoryleukocyteproteaseinhibitorSLPI)進(jìn)行研究，初步研究了SLPI對真皮多能干細(xì)胞的促增殖作用及其可能的機(jī)制。 主要

5、結(jié)果和結(jié)論如下： 1.本實驗分離、純化的真皮多能干細(xì)胞形態(tài)較為均一，多次傳代后仍能保持很強(qiáng)的增殖能力；在一定的誘導(dǎo)條件下，真皮多能干細(xì)胞具有向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞分化的能力，這些結(jié)果提示，真皮多能干細(xì)胞具有自我更新能力和多向分化潛能，是一種較為原始和幼稚的間充質(zhì)多能干細(xì)胞。傷后不同時相傷口液對真皮多能干細(xì)胞均具有刺激作用，表現(xiàn)為真皮多能干細(xì)胞增殖力和遷移力均顯著增加，但傷后早期傷口液作用最為明顯，提示真皮多能干細(xì)胞不僅是一

6、種重要的組織修復(fù)細(xì)胞，而且在創(chuàng)傷修復(fù)啟動中可能具有重要意義。 2..我們通過基因芯片對已經(jīng)獲得的cDNA消減文庫進(jìn)行篩選和鑒定，得到13個創(chuàng)傷早期傷口液作用真皮多能干細(xì)胞高表達(dá)的靶分子，測序得到SLPI、中性粒細(xì)胞趨化因子-2(CINC-2(等7個已知序列的差異表達(dá)基因。這些差異表達(dá)基因的發(fā)現(xiàn)對于從基因水平闡明創(chuàng)傷愈合的分子機(jī)制可能具有重要意義，可望為創(chuàng)傷促愈措施提供新思路和新靶點。 3.RT-PCR提示傷口局部皮膚組織

7、和傷口液作用24h后真皮多能干細(xì)胞中SLPI，CINC-2mRNA含量均顯著升高，免疫組織化學(xué)結(jié)果提示傷口液作用后真皮多能干細(xì)胞中熱休克蛋白70(HSP70)，基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP3)蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)。結(jié)合參考文獻(xiàn)和對差異表達(dá)基因的初步研究，我們預(yù)測SLPI、CINC-2、MMP3和HSP70在創(chuàng)傷愈合中有重要意義。 4.通過[H3]Thymidine摻入實驗發(fā)現(xiàn)加入SLPI后，細(xì)胞有絲分裂顯著增強(qiáng)。RT-PCR提示在SLP