Ski在細胞增殖、創(chuàng)傷愈合及瘢痕形成中作用與意義研究.pdf

1、細胞增殖是生命的基本特征，不但參與個體的發(fā)育、機體的修復等生理過程，而且參與難愈、瘢痕形成、腫瘤發(fā)生等病理過程。因此，合理調(diào)控細胞增殖，不僅有利于促進組織修復，而且對提高修復質(zhì)量，抑制瘢痕乃至腫瘤形成具有重要意義。創(chuàng)傷愈合發(fā)生率極高，且緩慢的愈合過程和不良的愈合結果（例如增生性瘢痕和瘢痕疙瘩）是人類創(chuàng)傷愈合領域所面臨的兩大難題。盡管目前促進創(chuàng)傷愈合和抑制過度瘢痕形成的治療方法有很多，但是，在促愈和瘢痕治療之間還存在著一定的矛盾：如生長因

2、子類促愈治療的同時具有加重瘢痕形成的風險；對于瘢痕的治療目前主要依賴經(jīng)驗性治療，且治療效果不好，有的副作用大甚至影響愈合。另外，由于存在創(chuàng)傷后創(chuàng)面受體表達容易發(fā)生缺乏及變異、創(chuàng)面局部蛋白酶濃度升高、蛋白酶和其抑制因子比例失衡等因素，使受體類治療途徑難以達到理想促愈效果。因此，尋求新的非受體作用途徑的促增殖劑，對促進創(chuàng)傷愈合尤其是放創(chuàng)復合傷、大面積創(chuàng)傷、燒傷等難愈傷口有著十分重要的意義。
　　 C-Ski作為一種鳥類癌基因v-sk

3、i的細胞內(nèi)同源物蛋白，在各種動物中有較高的同源性，在人體中稱之為Ski。Ski在不同類型的組織和細胞中分布廣泛，不僅可以抑制Smad3/2 活性，還可調(diào)節(jié)多種核因子的轉錄活性，如促進NFI（促核因子I）的轉錄、抑制癌基因Rb的轉錄等，從而參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、造血細胞的增殖和分化、腫瘤發(fā)生、組織再生等多種生理、病理過程。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Ski是一創(chuàng)傷修復相關基因，繼而，在大鼠切割傷模型上的轉基因?qū)嶒炞C實Ski 具有在促愈的同時減輕瘢痕形成的

4、雙重作用，并在兔耳增生瘢痕模型上得到了驗證。并且Ski表現(xiàn)出比現(xiàn)有促愈措施或抗瘢痕方法更好的效果，這不僅為同時實現(xiàn)促進創(chuàng)傷愈合和抑制瘢痕形成這看似矛盾的效應成為可能，而且提示Ski 可能是一個具有治療難愈性傷口和增生性瘢痕的臨床應用前景的分子。
　　 已有文獻及前期研究表明Ski 可能是一個細胞增殖的調(diào)節(jié)因子，并具有促進愈合和減輕瘢痕的雙重作用，但是，其在細胞增殖、創(chuàng)傷愈合及瘢痕形成中的作用機制還不清楚，尤其，作為原癌基因的Sk

5、i在多種人類惡性腫瘤中顯著表達，在這種細胞無限增殖病理過程中作用如何所知不多，不但影響其生物學效應的闡明，也嚴重制約了其在創(chuàng)傷治療中的應用前景。不過，已有研究表明Smad3 具有抑制細胞增殖的作用，表明抑制Smad3 可具有促進增殖作用；同時，1999年美國NIH小組首次報道，Smad3基因敲除小鼠的傷口愈合速率增加了2倍，這一結果證實了抑制Smad3 具有促愈作用；
　　 另外，近些年研究表明TGF-beta信號系統(tǒng)尤其是Sm

6、ad3/2信號因子（他們轉導的信號系統(tǒng)也稱為TGF-β1/Smad 依賴途徑）高活性是導致瘢痕形成的重要原因，因此，抑制Smad3/2 成為了減輕瘢痕形成的新途徑。而且，TGF-β1/Smad 依賴途徑抑制細胞增殖作用從而使TGF-β1具有抗腫瘤發(fā)生作用，此途徑的功能障礙被認為是TGF-β1抗腫瘤作用喪失的原因。這些都提示Ski基因作為Smad3、Smad2的輔阻遏子，其可能通過調(diào)節(jié)Smad3/2 而在促進增殖、傷口愈合、瘢痕形成甚至腫

7、瘤發(fā)生等方面發(fā)揮作用，是否如此需要進一步的證實。
　　 為此，本課題在前期研究的基礎上，分三個部分進行如下研究：（1）Ski在細胞增殖及TGF-β1調(diào)節(jié)增殖中的作用研究：本部分研究采用原代成纖維細胞（Fibroblast，F(xiàn)B）和纖維肉瘤細胞（L929），通過體外實驗，在明確TGF-β1對FB和L929 增殖調(diào)節(jié)作用不同的基礎上，利用RNAi 干擾c-Ski后結合TGF-β1刺激來驗證Ski在其調(diào)節(jié)增殖中所發(fā)揮的作用，并探討其促

8、進增殖的機理是否與其抑制Smad3/2 有關；進一步，采用纖維肉瘤細胞移植瘤模型，對TGF-β1通過調(diào)節(jié)Ski 來促進腫瘤生長進行驗證；
　　 （2）Ski在創(chuàng)傷愈合中的雙重作用和機理研究：首先，采用大鼠創(chuàng)傷及兔耳增生性瘢痕模型來觀察Ski 促愈和減輕瘢痕的雙重作用，并采用RNAi 干擾質(zhì)粒局部皮下注射來驗證Ski 雙重作用的特異性；進一步，利用Ski 裸質(zhì)粒治療大鼠創(chuàng)傷愈合模型，探討Ski 雙重作用的分子機制是否與調(diào)節(jié)TGF-

9、β1/Smad 依賴途徑有關；（3）Ski及TGF-β1/Smad 依賴途徑相關信號因子在人體增生性瘢痕中的表達觀察：利用收集的人體瘢痕標本來檢測Ski及其相關調(diào)節(jié)因子的表達規(guī)律，以此探討Ski在人體增生性瘢痕中的表達及與TGF-β1/Smad 依賴途徑的關系。
　　 主要結果與結論如下：
　　 1.在前期發(fā)現(xiàn)c-Ski 參與TGF-β1雙向調(diào)節(jié)FB細胞增殖變化作用的基礎上，本研究采用體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，c-Ski在L92

10、9細胞中持續(xù)高表達與TGF-β1對FB和L929的增殖調(diào)節(jié)存在著雙向到單向的轉變有關，并在動物移植瘤實驗中證實高表達的c-Ski促進移植瘤持續(xù)生長；此外，實驗發(fā)現(xiàn)與FB不同的是，L929細胞自分泌及移植瘤組織中的TGF-β1濃度持續(xù)增高。上述結果提示c-Ski是重要的細胞增殖調(diào)節(jié)因子，且其持續(xù)、過高表達可能是L929 腫瘤細胞持續(xù)增殖的重要原因，而L929 腫瘤細胞分泌高濃度TGF-β1是其發(fā)揮持續(xù)增殖作用的基礎。Ski的這一重要作用可

11、能是創(chuàng)傷后細胞增殖在創(chuàng)傷修復完成后能自動停止而腫瘤細胞不能停止的機制之一。
　　 2.前期實驗發(fā)現(xiàn)c-Ski的低表達增強Smad信號而c-Ski 高表達抑制Smad信號是高低濃度TGF-β1不同調(diào)節(jié)細胞增殖作用不同的原因。本研究通過L929細胞體外實驗發(fā)現(xiàn)，高表達的Ski 雖然沒有改變Smad2/3的磷酸化水平，但可顯著抑制其下游信號因子P21的表達水平，提示高表達的c-Ski 可通過調(diào)節(jié)Smad 途徑參與TGF-β1的單向促進

12、L929 增殖作用；不過，實驗中還發(fā)現(xiàn)低濃度TGF-β1刺激24小時后，c-Ski表達水平增高但P21表達水平無明顯變化，而細胞增殖仍舊增高，提示高表達的c-Ski 促進L929 增殖作用存在調(diào)節(jié)非Smad 途徑的可能。上述結果不僅表明c-Ski 調(diào)節(jié)增殖作用的分子機制與抑制Smad信號系統(tǒng)有關，而且為其能通過調(diào)節(jié)細胞增殖而參與調(diào)節(jié)愈合奠定基礎。
　　 3.細胞研究發(fā)現(xiàn)Ski不但具有促增殖作用還有調(diào)節(jié)成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化

13、和膠原分泌等作用。本實驗通過對人體瘢痕標本的檢測，發(fā)現(xiàn)在病理性瘢痕中Ski表達相對較低而TGF-β1/Smad信號系統(tǒng)高表達，這不但為確定Ski在瘢痕形成中的作用提供了線索，也進一步驗證了TGF-β1/Smad信號系統(tǒng)在病理性瘢痕中的促進作用。
　　 結合前期轉染Ski 實驗可逆轉Smad3對成纖維細胞的促膠原分泌和抑制組織Smad信號及瘢痕形成的結果，表明低表達的Ski降低了對TGF-β1/Smad信號系統(tǒng)的抑制是病理性瘢痕形

14、成的原因之一，這為今后Ski在瘢痕形成中的作用及機制研究提供了有用的線索。
　　 4.前期通過轉ski基因?qū)嶒炘诖笫髣?chuàng)傷模型中發(fā)現(xiàn)Ski 具有促愈和減輕瘢痕形成的雙重作用，且在兔耳增生性瘢痕模型上也取得同樣的結果。本研究采用RNAi 方法在大鼠創(chuàng)傷模型中發(fā)現(xiàn)干擾不僅顯著降低Ski表達水平，同時傷口愈合減慢和愈后瘢痕面積增大，這反向確認了Ski 雙重作用來自于其本身。這不僅使同時實現(xiàn)促進創(chuàng)傷愈合和抑制瘢痕形成這看似矛盾的效應成為可

15、能，也為創(chuàng)傷愈合和瘢痕的早期干預性治療提供了新的思路。
　　 5.大鼠創(chuàng)傷模型愈合過程的病理學及免疫組化分析結果表明，新生上皮中c-Ski表達增高，且轉ski基因使其表達進一步提高的同時使新生上皮明顯增多、爬行更遠；
　　 轉ski基因側肉芽組織增多，Cyclin D和Col l表達增高且與Ski表達增高一致；另外，轉ski基因側創(chuàng)面內(nèi)CD11b(代表粒細胞和巨噬細胞等炎性細胞標志)陽性細胞減少。上述結果提示轉ski基因

16、除調(diào)節(jié)增殖作用外，還可可通過減輕炎癥反應、加快上皮化、增加肉芽形成而達到促進愈合作用。
　　 6.大鼠創(chuàng)傷模型愈后瘢痕的病理學及免疫組化分析結果表明，轉ski基因側膠原排布似網(wǎng)狀，瘢痕膠原成熟度高更接近正常皮下膠原，而且α－SMA 陽性細胞減少、Col l表達降低，提示轉ski基因可通過減少膠原沉積和加快瘢痕組織重構而達到抑制瘢痕形成作用。
　　 7.大鼠創(chuàng)傷模型的分子檢測結果表明，轉ski基因抑制了Smad3/2的磷酸