圓盤狀受體（DDR）在瘢痕疙瘩形成和增殖中的作用.pdf

1、目的：研究圓盤狀受體(DDR)在瘢痕疙瘩形成和增殖中的作用。方法：以瘢痕疙瘩組織和KFb為對象，應(yīng)用IHC、FQ-PCR，WB、RT-PCR研究DDR在瘢痕疙瘩中的表達(dá)；應(yīng)用MTS、FCM、[3H]PI研究DDR對KFb凋亡、增殖和膠原合成分泌的影響；應(yīng)用DDR-ASODN研究阻斷DDR表達(dá)對KFb增殖、凋亡和膠原合成分泌的影響。結(jié)果：瘢痕疙瘩組織中DDRs含量顯著增加。KFb中DDR蛋白、mRNA表達(dá)水平也增高，其下游相關(guān)信號分子MM

2、P-1、MMP-2、P53mRNA和蛋白表達(dá)水平也增高。應(yīng)用DDR-ASODN，KFb增殖、膠原合成和分泌具有顯著抑制作用，并促KFb凋亡。結(jié)論：DDR及其下游信號分子MMP-1、MMP-2、P53在瘢痕疙瘩中表達(dá)明顯增加。DDR-ASODN對KFb凋亡、增殖、膠原合成和分泌具有顯著抑制作用。DDR可能是瘢痕疙瘩的不斷增殖的機(jī)制之一，而抑制DDR表達(dá)是防治瘢痕疙瘩的新思路。 研究目的：創(chuàng)傷后或無明顯原因?qū)е缕つw破損后皮膚傷口愈合是

3、一個動態(tài)、復(fù)雜的過程，病理性瘢痕形成是臨床上常見問題。它分為增生性瘢痕和瘢痕疙瘩形成。表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞持續(xù)增殖，細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，降解減少。而瘢痕疙瘩尤甚，其瘢痕增生高出皮面，并向周圍正常皮膚浸潤，形成局部畸形影響外觀，常伴有疼痛和瘙癢感，可持續(xù)多年，很少自行消退，單純手術(shù)切除后容易復(fù)發(fā)。目前本病發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，因此臨床上缺乏有效的防治方法。瘢痕疙瘩形成涉及眾多病理生理變化，與許多纖維化疾病和腫瘤形成有相似之處，目前研究深入到細(xì)

4、胞分子生物學(xué)方面，重點(diǎn)研究胞外信號如何通過細(xì)胞表面受體傳遞到核內(nèi)，產(chǎn)生基因調(diào)控，最終刺激成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生或調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)。對于成纖維細(xì)胞及其周圍微環(huán)境相互作用的研究將有助于其發(fā)病機(jī)制的了解和最終解決這一臨床難題，并對其他纖維性疾病和腫瘤研究提供借鑒。 將細(xì)胞外信號從胞膜傳遞到胞內(nèi)特定區(qū)域，信號途徑可通過改變靶蛋白上的酪氨酸，絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化起作用。其中酪氨酸激酶表達(dá)促殘基磷酸化，而且磷酸化也作為二級信號在瘢痕疙瘩形成中起

5、作用。目前研究認(rèn)為酪氨酸激酶是細(xì)胞信號傳遞途徑的關(guān)鍵成分，在控制細(xì)胞生長，分化，代謝和遷移方面起關(guān)鍵作用。 圓盤狀受體(Discoidindomainreceptors，DDR)是新近發(fā)現(xiàn)的屬于受體酪氨酸激酶家族的成員，最早屬于孤兒受體。它有兩個成員，DDR1和DDR2。二者均為膠原受體，是膠原形成量和質(zhì)的傳感器，在調(diào)控膠原產(chǎn)生方面起重要作用。它被膠原激活，將胞外信號向胞內(nèi)傳遞，調(diào)控細(xì)胞反應(yīng)，產(chǎn)生黏附、遷移、增殖、分化和ECM生

6、成。它在正常成人組織中低水平表達(dá)，主要功能是通過調(diào)控膠原合成、降解、酶活性并監(jiān)控ECM形成。當(dāng)細(xì)胞及其周圍內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變時，DDR表達(dá)增高，并使其下游信號發(fā)生相應(yīng)改變。DDR1，2受體表達(dá)和信號異常，導(dǎo)致基質(zhì)降解，重塑異常，與腫瘤浸潤，動脈粥樣硬化和肝，肺纖維化，瘢痕疙瘩等疾病相關(guān)。DDR作用獨(dú)立于整合素受體，其信號傳導(dǎo)途徑與整合素存在“交叉”對話；與黏附分子信號傳導(dǎo)途徑也存在“交叉”對話，與其他酪氨酸激酶如EGF作用信號途徑不同。近年

7、來國外對DDR研究主要集中在炎癥反應(yīng)，細(xì)胞抗凋亡和腫瘤研究方面，研究表明，DDR在介導(dǎo)炎癥，保護(hù)細(xì)胞免受凋亡，腫瘤浸潤方面起重要作用，對于DDR在病理性瘢痕中表達(dá)，國內(nèi)尚無人報(bào)道，國外文獻(xiàn)僅有兩篇涉及。但對DDR在病理性瘢痕形成中作用機(jī)制，信號傳導(dǎo)途徑研究尚未見報(bào)道。 本研究試圖對DDR在瘢痕疙瘩中表達(dá)及其信號傳導(dǎo)途徑進(jìn)行探討，研究其對瘢痕疙瘩形成的影響，并采用基因治療方法，通過利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染DDR-ASODN阻斷DDR表達(dá)，來

8、進(jìn)一步研究DDR在瘢痕疙瘩形成中作用，并探索通過抑制DDR表達(dá)進(jìn)行臨床防治瘢痕疙瘩形成的可能性。 研究方法：本實(shí)驗(yàn)分為兩部分。1、研究DDR及其相關(guān)信號在正常組織和瘢痕疙瘩皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)：通過IHC，F(xiàn)Q-PCR、WB、RT-PCR檢測DDR1，DDR2;DDR1及相關(guān)下游信號P53，MMP-1，MMP-2和磷酸酪氨酸mRNA、蛋白水平的表達(dá)。 2、阻斷DDR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對瘢痕疙瘩細(xì)胞生物學(xué)的行為改變：①研究阻斷D

9、DR受體對下游信號如P53，MMP-1，MMP-2和磷酸酪氨酸的影響。將DDR-ASODN分為1μmol/ml、5μmol/ml和20μmol/ml三種濃度，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，在48小時后收獲細(xì)胞，進(jìn)行DDR及相應(yīng)下游信號的mRNA及蛋白測定②阻斷DDR1受體表達(dá)對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、凋亡的影響。將以上轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分別于6，12，48，72小時，進(jìn)行MTS和流式細(xì)胞測定。③阻斷DDR1表達(dá)對瘢痕細(xì)胞膠原合成和分泌的影響。將上述轉(zhuǎn)染的細(xì)胞

10、于48小時后進(jìn)行[3H]脯氨酸摻入和RT-PCR的方法研究對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞膠原合成分泌的影響。 研究結(jié)果： 1.根據(jù)免疫組化結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩組織內(nèi)廣泛，高密度表達(dá)DDR，呈致密條帶狀和團(tuán)塊狀，上皮基底DDR致密表達(dá)，而正常組織內(nèi)散在，零星，低密度DDR表達(dá)，上皮基底無DDR表達(dá)。使用計(jì)算機(jī)圖象分析法，顯示正常組織與瘢痕疙瘩差異有顯著性(P＜0.05)。熒光定量PCR結(jié)果顯示，瘢痕疙瘩中DDR1為20.98±10

11、.3，而正常組織中為4.23±2.8，差異具顯著性(P＜0.01)；瘢痕疙瘩中DDR2為358±34.5，而正常組織中為278±42.1，差異具顯著性(P＜0.05)。 2.根據(jù)RT-PCR結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中，DDR1表達(dá)較正常組織皮膚成纖維細(xì)胞顯著增高，約為正常的4倍(P＜0.01)。而其下游信號P53，MMP-1，MMP-2，磷酸酪氨酸表達(dá)也顯著增高，分別為正常2(P＜0.05)，2.3(P＜0.05)，1.7

12、(P＜0.01)倍。 3.根據(jù)WesternB1ot結(jié)果，在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中，有極高的DDR1表達(dá)，約為正常的7倍(P＜0.01)。而其下游信號P53，MMP-1，MMP-2，磷酸酪氨酸表達(dá)也顯著增高，分別為正常1.5(P＜0.05)，3.8(P＜0.05)，2.3(P＜0.01)倍。 4.通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染DDR1-ASODN，發(fā)現(xiàn)①通過流式細(xì)胞分析，脂質(zhì)體攜帶的反義寡核苷酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，12小時達(dá)高峰，在有效轉(zhuǎn)染率達(dá)5

13、0％，最高達(dá)63％?？沙掷m(xù)4天之久。②DDR1mRNA及蛋白表達(dá)下降，而相應(yīng)下游信號P53、MMP-1、MMP-2、磷酸酪氨酸mRNA及蛋白表達(dá)下降。且DDR1、P53、MMP-1和MMP-2mRNA及蛋白表達(dá)隨脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染DDR1-ASODN濃度增高而下降，下降具有顯著性意義。③MTX檢測和流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞在轉(zhuǎn)染DDR-ASODN后，在不同時間點(diǎn)均顯示凋亡增加，增殖下降。并且表明，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡增加與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

14、DDR1-ASODN濃度有關(guān)，隨濃度增加，凋亡增加明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖下降與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染DDR1-ASODN濃度有關(guān)，隨濃度增加，增殖下降明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但增殖下降似低于凋亡增加。另外，MTX檢測結(jié)果與MTT檢測結(jié)果具有可比性。二者相差結(jié)果不大，但MTX結(jié)果更準(zhǔn)確，操作更方便。④瘢痕疙瘩皮膚成纖維細(xì)胞在轉(zhuǎn)染DDR1-ASODN后，膠原合成和分泌下降(P＜0.05)。RT-PCR顯示，a1(Ⅰ)前膠原mR

15、NA的表達(dá)明顯下降。a1(Ⅲ)前膠原mRNA表達(dá)也下降，但a1(Ⅰ)前膠原mRNA表達(dá)下降明顯大于a1(Ⅲ)前膠原mRNA表達(dá)下降，且二者之間比例反而縮小。 研究結(jié)論： 1.瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞DDR的表達(dá)較正常皮膚成纖維細(xì)胞顯著增加。 2.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染DDR1-ASODN能在短時間內(nèi)高效表達(dá)于目的細(xì)胞。 3.使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染DDR1-ASODN后，可阻斷瘢痕疙瘩皮膚成纖維細(xì)胞DDR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，下調(diào)內(nèi)源性P53，