PPM1M對(duì)NF-κB信號(hào)通路調(diào)控作用的研究.pdf

1、核因子kB(NF-kB)信號(hào)通路活性受到細(xì)胞質(zhì)多種蛋白的精細(xì)調(diào)控，NF-kB與這些蛋白質(zhì)組成了NF-kB系統(tǒng)，多種因素可引起NF-kB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活。NF-kB調(diào)控大量基因的轉(zhuǎn)錄，特別是一些涉及免疫應(yīng)答和炎癥應(yīng)答的基因，NF-kB信號(hào)通路參與了炎癥、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等方面的調(diào)控，目前所知的NF-kB所誘導(dǎo)表達(dá)的基因大多與細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活有關(guān)。蛋白磷酸酯酶2C(PP2C)家族成員大多與細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞應(yīng)激應(yīng)答的信號(hào)通路相關(guān)，其中金屬依

2、賴性蛋白磷酸酯酶1A(PPM1A)、PPM1B、PPM1L、PPM1F、PPM1E、整聯(lián)蛋白偶聯(lián)激酶相關(guān)的磷酸酯酶(ILKAP)等PP2C家族蛋白成員直接參與了NF-kB信號(hào)通路主要路徑或旁路的調(diào)控，但是PP2C蛋白家族蛋白成員PPM1M的底物與生理功能卻尚未證實(shí)，基于PPM1M的結(jié)構(gòu)和序列與上述PP2C家族蛋白的相似性，檢測(cè)了PPM1M在NF-kB信號(hào)通路中的功能。 采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)抑制PPM1M的mRNA表達(dá)，

3、從而研究其在NF-kB信號(hào)通路中的作用。本實(shí)驗(yàn)從3條不同的靶向PPM1M的小干擾RNA(siRNA)中篩選出最有效的1條siRNA，即PPM1MsiRNA1，并且用PPM1MsiRNA_1干擾PPM1M后發(fā)現(xiàn)抑制PPM1M的表達(dá)會(huì)降低NF-kB信號(hào)通路的活性。表達(dá)并純化了PPM1M-GST融合蛋白以用于PPM1M與NF-k信號(hào)通路中蛋白相互作用的研究。另外，本實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了腫瘤壞死因子α(TNFα)在Hela細(xì)胞中時(shí)間梯度的刺激效應(yīng)，結(jié)果

4、發(fā)現(xiàn)，從0分鐘到30分鐘核因子kB抑制子α(IkBα)的表達(dá)量逐漸下降，而60分鐘時(shí)IkBα的表達(dá)量開始上升，因此選擇30分鐘作為PPM1M定位實(shí)驗(yàn)的TNFα刺激時(shí)間。在免疫熒光蛋白定位實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：在Hela細(xì)胞中，非刺激狀態(tài)和刺激狀態(tài)下PPM1M均定位于細(xì)胞質(zhì)中，因此在相互作用實(shí)驗(yàn)中選擇NF-kB信號(hào)通路細(xì)胞質(zhì)部位的蛋白作為靶點(diǎn)，并且發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TRAF2)、核因子kB抑制子激酶β(IKKβ)和p52與PPM1M均