文昌魚原始NF-κB免疫調(diào)控通路的研究.pdf

1、迄今為止，適應性免疫的起源一直是免疫學研究的關(guān)鍵問題。文昌魚被認為是最接近于脊椎動物的祖先，自從他們被發(fā)現(xiàn)，一直是研究脊椎動物的起源與進化機制的經(jīng)典動物。 為了在頭索文昌魚中尋找適應性免疫系統(tǒng)的分子證據(jù)，本研究用副溶血弧菌及金黃色葡萄球菌長期感染文昌魚來調(diào)查免疫起源。在差減文庫中，許多急性期反應蛋白像補體因子3，鼠李糖結(jié)合因子，肽聚糖結(jié)合蛋白SC2等也出現(xiàn)在文庫中，同時，新的免疫基因象高密度脂蛋白，卵黃蛋白原等大量上調(diào)，暗示了與

2、急性期不同的免疫策略。而且，本文還論證了卷入脊椎動物負調(diào)控路徑的分子證據(jù)。為進一步調(diào)查這一過程的分子事件提供了重要線索，進一步功能研究這些新發(fā)現(xiàn)的基因?qū)⒂兄谏钊胙芯棵庖呦到y(tǒng)的起源和進化。 通過表達序列標簽策略分析不同的克隆，本研究發(fā)現(xiàn)匹配抑制NF-κB活性的A20結(jié)合蛋白的一個EST XP 692717在差減文庫中高度富集，通過RACE克隆了這個新基因，并命名為amphiABIN。序列分析表明amphiABIN與脊椎動物的AB

3、IN-2有最高的同源性。與人和小鼠的ABIN序列比對表明，該基因蛋白含有一個顯著的大約70個氨基酸的ABIN同源框。Northern雜交證明該基因在感染后顯著上調(diào)，尤其是第4周和第5周，這暗示了該基因在文昌魚的抗感染過程中發(fā)揮重要作用。原位雜交表明該基因主要在肝盲囊和性腺這兩個文昌魚的主要免疫器官表達，同時在胚胎發(fā)育的8小時到成魚階段也表達上調(diào)，表明該蛋白在免疫調(diào)節(jié)和胚胎發(fā)育中有重要作用。這些表達模式反應了ABIN家族在進化過程中的原始

4、功能或者說亞功能形式。 為探究amphiABIN基因在文昌魚基因組中的存在方式，對其進行了Southern blot分析。實驗結(jié)果證明amphiABIN在文昌魚基因組中以單拷貝的形式存在。通過NJ系統(tǒng)進化樹分析，發(fā)現(xiàn)amphiABIN在進化上與脊椎動物ABIN-2更為接近。這也暗示ABIN-1和ABIN-3可能是通過amplliABIN的復制所形成的，ABIN-1和ABIN-3在進化中可能獲得了新的功能，而amphiABIN則保

5、留原始的功能狀態(tài)。轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B在先天免疫和適應性免疫中發(fā)揮重要作用，NF-κ B的失控會產(chǎn)生過量的炎癥因子，并與慢性炎癥疾病及癌癥相關(guān)，所以必須嚴格控制。但是關(guān)于NF-κ B的調(diào)控機制并不是很清楚，尤其是在無脊椎到脊椎動物的轉(zhuǎn)變過程中。研究結(jié)果顯示與脊椎動物該成員類似，amptliABIN的過表達顯著地抑制腫瘤壞死因子和白細胞介素1引起的NF-κ B活性減少，表明ABIN成員在進化過程中對NF-κ B調(diào)控的保守性。突變分析表明，

6、像其他的脊椎動物成員一樣，AHD2結(jié)構(gòu)對這種抑制作用最為明顯。 通過免疫共沉淀和pull-down實驗，發(fā)現(xiàn)amphiABIN能特定的與文昌魚腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白TRAF2，TRAF4和TRAF6相互作用。與TRAF成員單獨表達增加NF-κ B活性比較，amplliABIN與TRAF成員共轉(zhuǎn)染顯著抑制NF-κ B的活性，進一步暗示了它們之間的相互作用。實驗還發(fā)現(xiàn)amphiABIN干擾NF-κ B的活性發(fā)生在TRAF2和TRA

7、F4下游，但對于TRAF6并沒有影響，可能是因為TRAF6只受白介1或者Toll受體的誘導。本文推測這種作用的形成可能是由于一旦amphiABIN與文昌魚TRAF結(jié)合，從而競爭TRAF與下游信號分子IKK γ的結(jié)合，導致NF-κ B激活的失敗。除了抑制NF-κ B，amphiABIN在細胞中還呈現(xiàn)抗凋亡的活性，這也為該基因在細菌感染后的所發(fā)生的保護效應提供了合理解釋。 總之，本文第一次報道了文昌魚長期感染的分子表達譜，論證了am