文昌魚(yú)（Branchiostoma belcheri）體內(nèi)細(xì)菌清除機(jī)制及免疫致敏作用研究.pdf

1、文昌魚(yú)屬于脊索動(dòng)物門(mén)，頭索動(dòng)物亞門(mén)，是與脊椎動(dòng)物親緣關(guān)系最接近的無(wú)脊椎動(dòng)物，一直被認(rèn)為是研究脊椎動(dòng)物起源和進(jìn)化的模式生物。近年來(lái)，人們開(kāi)始在文昌魚(yú)中探索免疫系統(tǒng)的起源和進(jìn)化。本文通過(guò)細(xì)菌感染文昌魚(yú)，研究了文昌魚(yú)清除體內(nèi)細(xì)菌的免疫機(jī)制，并通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)文昌魚(yú)的補(bǔ)體關(guān)鍵基因表達(dá)模式以及是否存在免疫致敏作用作了研究。 首先，通過(guò)用綠色熒光蛋白標(biāo)記的大腸桿菌感染文昌魚(yú)，將文昌魚(yú)切成小段把體液涂抹于載玻片上，在熒光顯微鏡下

2、觀察體液中細(xì)菌，證明文昌魚(yú)能有效清除入侵的異源微生物。這是在頭索動(dòng)物中關(guān)于體內(nèi)細(xì)菌清除的首次報(bào)道。血細(xì)胞的吞噬作用被認(rèn)為是無(wú)脊椎動(dòng)物清除細(xì)菌的最重要途徑。我們通過(guò)組織切片法在文昌魚(yú)體內(nèi)尋找包含大腸桿菌的細(xì)胞，至少在2000條文昌魚(yú)中都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何吞噬有大腸桿菌的細(xì)胞，表明文昌魚(yú)既使具有自由循環(huán)的巨噬細(xì)胞，也不是其清除入侵大腸桿菌的主要因素。而體液可能是清除細(xì)菌的主要成分，為了確定文昌魚(yú)體液中哪些成分參與了細(xì)菌清除作用，我們通過(guò)體外殺菌來(lái)

3、分析。提取文昌魚(yú)體液，把細(xì)菌加入其中，然后于不同時(shí)間取樣涂布平板，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。發(fā)現(xiàn)體液對(duì)大腸桿菌具有較強(qiáng)的殺滅活性。通過(guò)特異性抗體抑制發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體和溶菌酶是參與文昌魚(yú)體液殺菌作用的重要體液因子。相比之下，補(bǔ)體較溶菌酶作用更強(qiáng)。為進(jìn)一步確定哪些補(bǔ)體激活途徑參與了文昌魚(yú)體液的殺菌作用，通過(guò)分別抑制特定的補(bǔ)體途徑，進(jìn)而比較體液殺菌活性變化的方法，發(fā)現(xiàn)主要是通過(guò)替代途徑激活參與細(xì)菌清除作用。Western blot結(jié)果顯示大腸桿菌感染后，文昌魚(yú)體

4、液中C3和溶菌酶水平均有明顯升高，進(jìn)一步證明，補(bǔ)體和溶菌酶確實(shí)是參與文昌魚(yú)體內(nèi)細(xì)菌清除的主要因子。 其次，用大腸桿菌和鰻弧菌持續(xù)感染文昌魚(yú)，在感染后的不同時(shí)間段取材，分別提取去腸魚(yú)和腸組織的RNA，運(yùn)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)研究補(bǔ)體系統(tǒng)關(guān)鍵基因的表達(dá)模式。研究發(fā)現(xiàn)文昌魚(yú)對(duì)大腸桿菌和弧菌兩種革蘭氏陰性菌的反應(yīng)性基本一致，補(bǔ)體基因的表達(dá)規(guī)律非常類(lèi)似。兩種細(xì)菌感染文昌魚(yú)后，與正常對(duì)照組相比，Bf、C3及C6三基因都存在不同程度的上調(diào)

5、。大腸桿菌感染后，腸中的表達(dá)在3h就達(dá)到最高值，而去腸魚(yú)中的表達(dá)在感染后的6h達(dá)到峰值。鰻弧菌感染后，腸中的表達(dá)在6h時(shí)上調(diào)最為顯著，而去腸魚(yú)中的表達(dá)在感染后的12h達(dá)到最高。這表示這些基因在文昌魚(yú)感染的急性階段可能發(fā)揮重要作用。有趣的是，MASP在感染后表達(dá)降低，這可能是細(xì)菌逃避機(jī)體補(bǔ)體系統(tǒng)殺傷，維護(hù)自身的一種機(jī)制。Bf、C3及C6三基因在腸中的總體表達(dá)水平，均高于在去腸魚(yú)中的表達(dá)，達(dá)到峰值的時(shí)間均比在去腸魚(yú)中的提前。MASP在感染后

6、，腸中表達(dá)的下調(diào)倍數(shù)也比在去腸魚(yú)中的高。這說(shuō)明文昌魚(yú)的消化系統(tǒng)可能是參與免疫的重要的器官，在清除外來(lái)微生物的免疫應(yīng)答中起著重要作用。 最后，分別用大腸桿菌和鰻弧菌對(duì)文昌魚(yú)進(jìn)行二次感染或交叉感染，運(yùn)用realtime RT-PCR技術(shù)對(duì)補(bǔ)體四個(gè)基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，以研究文昌魚(yú)的免疫系統(tǒng)是否具有免疫致敏作用。發(fā)現(xiàn)用同一種細(xì)菌二次感染后補(bǔ)體基因Bf、C3和C6的表達(dá)上調(diào)均比首次感染后顯著，達(dá)到峰值的時(shí)間都明顯提前，而且表達(dá)水平能

7、較長(zhǎng)時(shí)間維持在一個(gè)較高的水平。同樣，在兩種細(xì)菌交叉感染實(shí)驗(yàn)中，二次感染后基因表達(dá)上調(diào)明顯，但與同種細(xì)菌感染兩次相比，基因的上調(diào)倍數(shù)還是略低。所有這些特點(diǎn)與脊椎動(dòng)物的免疫致敏作用類(lèi)似，證明文昌魚(yú)免疫系統(tǒng)可能存在免疫致敏作用。 總之，本實(shí)驗(yàn)表明缺乏自由循環(huán)的血細(xì)胞的文昌魚(yú)能夠有效清除入侵的大腸桿菌。補(bǔ)體和溶菌酶是參與體內(nèi)細(xì)菌清除的主要因子，但補(bǔ)體的作用較溶菌酶更強(qiáng)。這是關(guān)于文昌魚(yú)清除體內(nèi)細(xì)菌機(jī)制及其相關(guān)因子的首次報(bào)道。通過(guò)熒光實(shí)時(shí)