文昌魚calreticulin基因的鑒定、表達和功能研究.pdf

1、鈣網(wǎng)蛋白（Calreticulin，CRT）是內質網(wǎng)中的主要Ca2+結合蛋白，分子大小46 kDa，由三個不同的結構功能域所組成，包括球狀的N-功能域，延伸的P-功能域和酸性的C-功能域。N-末端功能域有信號肽序列，指引蛋白到達內質網(wǎng)，有兩個半胱氨酸殘基，參與二硫鍵的形成，不同物種間N-末端的功能域均非常保守。相比之下，C-功能域是最不保守的，但是，該區(qū)域含有一個十分保守內質網(wǎng)滯留序列KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)。位于N-

2、功能域和C-功能域之間的是脯氨酸豐富的P-功能域。
　　迄今為止，CRT已經(jīng)在高等植物、無脊椎動物和脊椎動物得到廣泛鑒定，但是至今為止關于頭索動物文昌魚，這一個研究進化的重要的物種，報道卻很少。本文我們首次克隆并鑒定得到青島文昌魚（Branchiostoma japonicum）的CRT的cDNA序列，命名為Bjcrt。Bjcrt全長為2848 bp，包含一個1275 bp的開放閱讀框（ORF）,5'-端非翻譯區(qū)（5'-UTR）8

3、7 bp,和3'-端非翻譯區(qū)（3'-UTR）1486 bp的。預測文昌魚CRT由424個氨基酸組成，分子大小為約49.5 kDa，有一個16個氨基酸殘基疏水性信號肽序列，包括三個結構域(N-, P-, C-結構域)和一個內質網(wǎng)滯留信號，有CRT的典型特征，包括位于N-功能域的CRT家族典型特征序列KHEQKIDCGGGYI和 IMFGPDICG，P-功能域的兩個三倍重復序列 A(PXXIXDPDAXKPEDWDE)和B(GXWXPPXI

4、XNPXYX)，以及C-功能域末端的保守的內質網(wǎng)滯留序列（KDEL）。
　　基因結構分析顯示文昌魚和脊椎動物CRT外顯子/內含子結構一樣，都含有9個外顯子和8個內含子，而且每個編碼外顯子的長度與脊椎動物CRT基因如此的相似。表明CRT在脊索動物的演化過程中高度保守，為我們提供了一個有關CRT基因轉錄本的調控在頭索動物文昌魚和脊椎動物中是相似的的線索。系統(tǒng)進化分析表明青島文昌魚CRT基因位于脊椎動物CRT序列底部，表明文昌魚CRT基

5、因是脊椎動物CRT進化的原型。
　　CRT在文昌魚多個組織中（肝盲囊、鰓、肌肉、脊索、后腸、精巢和卵巢）特異性表達，其中在脊索中表達量最高。CRT是一個多功能蛋白，它的這種廣泛的組織分布可能與在不同組織中發(fā)揮作用有關，這需要進一步展開研究。
　　我們構建文昌魚CRT大腸桿菌體外表達系統(tǒng)，得到純化的文昌魚CRT重組蛋白BjCRT，首次驗證了純化的重組蛋白BjCRT能夠結合革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌，除此之

6、外，運用密度梯度離心的方法提起新鮮的鱸魚巨噬細胞，使用流式細胞儀技術分析得出文昌魚重組蛋白 BjCRT能夠促進鱸魚巨噬細胞對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的吞噬作用。文昌魚 CRT表現(xiàn)出顯著的調理素的功能，能夠促進宿主的吞噬細胞殺死入侵的細菌。
　　綜上所述，本論文研究了文昌魚 CRT基因的克隆、鑒定和表達方式。證明了文昌魚 CRT與革蘭氏陽性菌-金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌-大腸桿菌特異性結合，能夠促進巨噬細胞吞噬金黃色葡萄球菌和大腸