文昌魚(yú)補(bǔ)體因子C1q和C3a基因的鑒定、表達(dá)和功能研究.pdf

1、文昌魚(yú)是研究脊椎動(dòng)物起源與進(jìn)化的重要模式動(dòng)物，研究文昌魚(yú)補(bǔ)體系統(tǒng)有助于追溯脊椎動(dòng)物補(bǔ)體系統(tǒng)的起源。補(bǔ)體系統(tǒng)是先天性免疫的重要組成部分，它能夠幫助抗體和吞噬細(xì)胞清除病原微生物，從而起到連接先天性免疫和獲得性免疫的重要作用，其激活途徑一般認(rèn)為有經(jīng)典途徑、替代途徑和凝集素途徑3條途徑。我們從文昌魚(yú)體內(nèi)克隆得到補(bǔ)體類(lèi)C1q基因和C3a基因，并進(jìn)行了表達(dá)和功能研究。具體結(jié)果如下。
　　在對(duì)文昌魚(yú)基因組中C1q-like基因分析之后，我們從中

2、選擇并克隆了一個(gè)與脊椎動(dòng)物C1q序列相似度高、含有與IgG、C1r-C1s結(jié)合關(guān)鍵位點(diǎn)的基因。進(jìn)化分析顯示該基因與脊椎動(dòng)物C1q直系同源，因此我們將之命名為BjC1q。Real-timePCR分析表明BjC1q基因在文昌魚(yú)肝盲囊、后腸和脊索大量表達(dá)，并且其表達(dá)量在文昌魚(yú)受到免疫刺激（細(xì)菌、脂磷壁酸或脂多糖）之后顯著上升，這表明BjC1q參與免疫相關(guān)功能。接著，我們重組表達(dá)并純化了BjC1q蛋白以及它的膠原結(jié)構(gòu)域和gC1q結(jié)構(gòu)域，并利用E

3、LISA、Western blot、溶血活性測(cè)定、親和層析等技術(shù)，重點(diǎn)研究了BjC1q是否具有參與經(jīng)典激活途徑的能力。我們發(fā)現(xiàn)重組表達(dá)的BjC1q可以形成多聚體，這是C1q激活經(jīng)典途徑所必需的。與人C1q蛋白一樣，BjC1q及其gC1q結(jié)構(gòu)域能夠與脂磷壁酸、脂多糖結(jié)合，甚至還能與人IgG結(jié)合。與七鰓鰻C1q不同的是，BjC1q不具備凝集素活性。更重要的是，將BjC1q加入去除了C1q的人血清后，補(bǔ)體經(jīng)典途徑的溶血活性得以恢復(fù)。我們還進(jìn)一

4、步證實(shí)BjC1q能夠結(jié)合并激活人C1r-C1s。以上結(jié)果表明，BjC1q具有參與經(jīng)典激活途徑的能力。
　　為了深入探索文昌魚(yú)體內(nèi)是否存在類(lèi)C1q介導(dǎo)的補(bǔ)體激活系統(tǒng)，我們又進(jìn)行了下面一系列實(shí)驗(yàn)。首先，利用pull-down技術(shù)分離并鑒定了BjC1q的互作蛋白，該蛋白含有三個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，故命名為BjIgSF。BjIgSF-BjC1q的結(jié)合與IgG-C1q的結(jié)合相似，都具有激活經(jīng)典途徑的能力。另外，C4和C3沉降實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，文昌

5、魚(yú)體液具有激活C4和C3的能力，而去除BjC1q的體液或加熱至56℃的體液均失去激活能力。將BjC1q加入去除了BjC1q的文昌魚(yú)體液后，體液激活C4和C3的能力可以恢復(fù)，證明文昌魚(yú)體液中存在具有激活C4和C3能力的C1q-絲氨酸蛋白酶復(fù)合體。BjIgSF、BjC1q-絲氨酸蛋白酶復(fù)合體等成分的存在，表明文昌魚(yú)體內(nèi)存在一個(gè)由C1q介導(dǎo)的補(bǔ)體激活途徑。我們推測(cè)，類(lèi)似脊椎動(dòng)物簡(jiǎn)單的補(bǔ)體典途徑可能起源于文昌魚(yú)類(lèi)C1q介導(dǎo)的補(bǔ)體系統(tǒng)，這是關(guān)于脊

6、椎動(dòng)物經(jīng)典途徑起源的一個(gè)新觀點(diǎn)。
　　我們還在文昌魚(yú)中克隆得到C3a基因片段，將其命名為BjC3a，并通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)BjC3a進(jìn)行了重組表達(dá)。序列分析和同源建模顯示BjC3a蛋白結(jié)構(gòu)與人C3a的結(jié)構(gòu)相似，C-端都是α-螺旋結(jié)構(gòu)。人C3a的C-端α-螺旋部分具有殺菌功能，我們推測(cè)BjC3a具有抑菌功能，并通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該推測(cè)。另外，BjC3a參與免疫應(yīng)答的能力與脊椎動(dòng)物C3a相仿，實(shí)驗(yàn)證明BjC3a能夠增強(qiáng)鱸魚(yú)巨噬細(xì)胞的免疫

7、應(yīng)答能力，例如引起巨噬細(xì)胞的遷移，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬作用，還能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞應(yīng)對(duì)細(xì)菌時(shí)的呼吸爆發(fā)作用。我們同時(shí)重組表達(dá)了去除C-末端精氨酸的BjC3a，命名為BjC3a-desArg，并對(duì)其免疫活性進(jìn)行了同樣的檢測(cè)。脊椎動(dòng)物C3a的趨化因子功能以及調(diào)理功能會(huì)隨著血清羧肽酶對(duì)C3a的C-末端精氨酸的切除而失去，不過(guò)抑菌等功能得到保留。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BjC3a-desArg也保留了C3a抑菌和刺激呼吸爆發(fā)的能力，說(shuō)明了C3a-desArg