青島文昌魚(Branchiostoma japonicum)viperin表達(dá)和功能特性.pdf

1、Viperin是一種已被熟知的抗病毒蛋白，它會被類型Ⅰ、類型Ⅱ和類型Ⅲ干擾素，一些DNA和RNA病毒，LPS，poly(I∶C)強(qiáng)烈誘導(dǎo)。Viperin包含3個功能域，分別為具有兩親性α螺旋結(jié)構(gòu)的多變N-端，包含有C×3C×2C結(jié)構(gòu)的中間區(qū)域和非常保守的C-端。其中N-端對于viperin的亞細(xì)胞定位非常重要，中間區(qū)域的C×3C×2C結(jié)構(gòu)為radical-SAM酶的特有結(jié)構(gòu)，可以參與[4Fe-4S]簇的形成，介導(dǎo)一系列的氧化還原反應(yīng)，而

2、保守的C-端最近已經(jīng)被證實(shí)對于抗病毒功能是至關(guān)重要?，F(xiàn)已知，viperin存在于從魚類到哺乳動物的一些物種中，而在文昌魚中viperin的相關(guān)信息還未有報道。在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過PCR，RACE技術(shù)克隆得到一條可能是青島文昌魚viperin的基因，它的長度為1540bp，其中開放閱讀框(ORF)部分為1074bp，5'非翻譯區(qū)為71bp，而3'非翻譯區(qū)為395bp。通過該基因與人，黑猩猩，小鼠等12個物種進(jìn)行序列比對發(fā)現(xiàn)在青島文昌魚中該

3、基因與其他物種的viperin基因相似度為60.7％～87.8％，且該基因的N-端同樣多變，而中間區(qū)域和C-端則非常保守。而后對該基因的結(jié)構(gòu)分析我們發(fā)現(xiàn)，該基因與其他物種的viperin基因一樣，同樣包含四個保守的模序，其中模序1含有C×3C×2C結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明該基因編碼的蛋白含有Elp3結(jié)構(gòu)域，屬于MoaA超家族，有radical-SAM酶的活性。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測則表明該基因編碼的蛋白與其他物種中的viperin蛋白有非常

4、相似的三級結(jié)構(gòu)。這些都表明我們所獲得的基因正是viperin基因，因此我們將它命名為Bjvip。之后我們對viperin基因在3種文昌魚和24種魚的進(jìn)化選擇壓力分析表明，在位點(diǎn)模型中，viperin基因在進(jìn)化中存在正向選擇的位點(diǎn)，且這些位點(diǎn)都位于N-端。而在支-特異模型中，二比率模型并未篩選出受到正向選擇壓力的支系。共線性分析表明在所分析的除鴨嘴獸外的脊索動物中，viperin(RSAD2)總會與CMPK2連接在一起，這表明CMPK2-

5、RSAD2的連接在脊索動物的進(jìn)化中是高度保守的。通過對viperin基因在青島文昌魚中的表達(dá)模式分析我們發(fā)現(xiàn)Bjvip主要在肝盲囊，肌肉，鰓，后腸中表達(dá)，而在卵巢，脊索，精巢中少量表達(dá)。這表明viperin在青島文昌魚中的表達(dá)有組織特異性。而通過poly(I∶C)刺激青島文昌魚后我們發(fā)現(xiàn)，Bjvip在所有檢測的組織（肝盲囊，肌肉，鰓，后腸）中表達(dá)量均明顯升高，表明poly(I∶C)的刺激可以誘導(dǎo)Bjvip的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證BjVip

6、蛋白是否也同樣具有抗病毒功能，在體外實(shí)驗(yàn)中，通過構(gòu)建真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染入FG細(xì)胞后，用LCDV病毒感染細(xì)胞，并通過qRT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)病毒的相對數(shù)量，結(jié)果顯示，在病毒感染48h和72h時，轉(zhuǎn)染目的蛋白組病毒相對數(shù)量明顯比轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組病毒相對數(shù)量要低。表明BjVip蛋白可以對抗LCDV病毒的復(fù)制。而在體內(nèi)試驗(yàn)中，通過構(gòu)建原核表達(dá)載體表達(dá)并驗(yàn)證rBjVip蛋白后與WSSV孵育并注射入蝦體中，結(jié)果顯示，在注射后8到24h，rBjVip蛋