青島文昌魚Antithrombin基因的克隆、表達(dá)和功能分析.pdf

1、凝血是一個由多種蛋白質(zhì)因子參與的復(fù)雜的級聯(lián)過程。在哺乳動物中，與凝血相關(guān)的因子都是高度保守的。除此之外，在兩棲類，爬行類，魚類和鳥類中也發(fā)現(xiàn)了類似功能的凝血系統(tǒng)的相關(guān)因子。最近研究表明無頜類七鰓鰻中含有類似、脊椎動物的凝血因子，但是在尾索動物海鞘中并沒有發(fā)現(xiàn)類似的凝血因子存在。文昌魚(amphioxus)是介于無脊椎動物和脊椎動物之間的過渡類型，是現(xiàn)存的與脊椎動物祖先最接近的原索動物，是研究脊椎動物起源和進(jìn)化的重要模式動物。研究文昌魚體

2、內(nèi)是否存在凝血系統(tǒng)的相關(guān)因子對于探索凝血系統(tǒng)的起源與進(jìn)化有著重要的意義。 抗凝血酶(antithrombin)是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族(serpin)的成員之一，是凝血系統(tǒng)中的一個關(guān)鍵蛋白，作為凝血酶的主要抑制劑在血液凝集過程中維持著凝血與抗凝的平衡。 本文克隆了青島文昌魚(Branchiostoma belcheri tsingtaunese)的抗凝血酶基因，命名為BbAT，并對它的結(jié)構(gòu)、進(jìn)化、表達(dá)和功能進(jìn)行了研究

3、。 首先，利用兼并引物PCR和RACE技術(shù)克隆得到了具有完整編碼框的文昌魚的抗凝血酶基因(BbAT)，并利用生物信息學(xué)方法對其基因結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化地位進(jìn)行分析。該cDNA的閱讀框編碼338個氨基酸，在1-336個氨基酸殘基之間包含一個完整的serpin結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明它屬于serpin超家族的C分支(antithrombin)，但是與B分支(較古老的一類serpin)也有一定的同源性。進(jìn)一步將BbAT和其他物種的anti

4、thrombin比較，發(fā)現(xiàn)此蛋白分別和爪蟾，鴕鳥，和人的antithrombin同源性較高，大約有40％的同源性。對BbAT的結(jié)構(gòu)預(yù)測表明：其3個β-折疊和7個α-螺旋的結(jié)構(gòu)與人的類似，尤其是它的反應(yīng)中心環(huán)(RCL)在氨基酸組成上與脊椎動物的具有高度的相似性，這表明BbAT的功能很可能與脊椎動物的類似。 哺乳動物的肝臟是antithrombin基因的主要合成器官，其他臟器如肺、脾、腎、心、腸、腦等也有少量合成。長期以來，文昌魚

5、的肝盲囊一直被認(rèn)為是脊椎動物肝臟的前體。利用原位雜交技術(shù)檢測BbAT在mRNA水平上在成體文昌魚中的組織表達(dá)模式，結(jié)果表明BbAT基因在肝盲囊表達(dá)量較高，在卵巢、后腸、腮也有表達(dá)，而在精巢、肌肉、神經(jīng)管和脊索沒有雜交信號?？梢?，與哺乳動物類似，BbAT基因在成體文昌魚組織中呈組織特異性表達(dá)。 為了了解文昌魚的BbAT是否與脊椎動物的一樣具有抑制凝血酶的功能。本文利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)體外表達(dá)了BbAT的重組蛋白，命名為rBbAT

6、。并用原核表達(dá)的重組蛋白制備了多克隆抗體，分別用發(fā)色底物法和Western blot的方法驗證了rBbAT的蛋白功。利用發(fā)色底物試劑盒，根據(jù)以人的標(biāo)準(zhǔn)血漿為標(biāo)準(zhǔn)品制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出rBbAT抑制凝血酶的活力呈濃度依賴性，且肝素對它的抑制活力有一定的促進(jìn)作用。另外rBbAT可以與凝血酶形成一種穩(wěn)定的復(fù)合物，且體內(nèi)也存在著的天然BbAT也有類似功能。 綜合以上結(jié)果，我們認(rèn)為：文昌魚體內(nèi)存在著一類antithrombin，且其功能