青島文昌魚transferrin-like基因的克隆、表達(dá)和功能研究.pdf

1、轉(zhuǎn)鐵蛋白是一種非血紅素結(jié)合的β-球蛋白，它具有兩個鐵離子(Fe3+)結(jié)合位點，可以結(jié)合兩個鐵離子。多個物種轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)構(gòu)、功能、序列和表達(dá)已有了深入的研究。但是，關(guān)于文昌魚轉(zhuǎn)鐵蛋白的研究卻未見報道。文昌魚是無脊椎動物進(jìn)化到脊椎動物的過渡類群的典型代表，一直被認(rèn)為是研究脊椎動物起源和進(jìn)化的模式動物。本文從青島文昌魚(Branchiostoma belcheri)消化道cDNA文庫中，分離到一段具有完整3’末端的transferrin-li

2、ke基因(BbTfl)，然后對該基因序列進(jìn)行了克隆，并對其結(jié)構(gòu)、鑒定、表達(dá)和功能進(jìn)行了研究。 首先，我們從頭索動物文昌魚中克隆出類轉(zhuǎn)鐵蛋白基因(BbTfl)并對其序列進(jìn)行了分析。其最大開放閱讀框編碼1256個氨基酸的蛋白質(zhì)(理論分子量為148kDa)，含有一個N末端的信號肽，屬于分泌型蛋白。該cDNA編碼的蛋白BbTfl，其N-端和C-端具有保守的transferrin結(jié)構(gòu)域。但其C-端結(jié)構(gòu)域有一個巨大的插入片段，這與脊椎動物

3、及無脊椎動物中的轉(zhuǎn)鐵蛋白都不同，但是與已報道的海膽的主要卵黃蛋白(MYP)極為相似，均屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族。將BbTfl完整的N-端結(jié)構(gòu)域同其他Tfs進(jìn)行序列比對發(fā)現(xiàn)，該蛋白與各物種中Tfs的同源性較低，但是12個半胱氨酸殘基的位置很保守，說明他們可能具有相似的三級結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，包括文昌魚BbTfl在內(nèi)的無脊椎動物Tfs聚為一個類群，脊椎動物的Tfs聚為一個類群，且文昌魚BbTfl位于脊椎動物Tfs的基部。 其次，我們對

4、transferrin-like基因在青島文昌魚中的表達(dá)情況做了研究。Northern blot結(jié)果顯示，BbTfl基因在青島文昌魚的肝盲囊和后腸中的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為一條帶，大小為4100bp左右，與我們從文昌魚中克隆的BbTfl cDNA的大小基本一致。切片原位雜交分析表明，BbTfl在成體文昌魚組織中呈特異性表達(dá)，在肝盲囊和后腸中的表達(dá)量最高。用革蘭氏陰性菌感染文昌魚后，腸中BbTfl基因表達(dá)水平在12和24小時顯著升高。因此，推測文昌魚

5、BbTfl可能是一種急性時相蛋白，參與宿主免疫防御。 為了在蛋白水平上驗證文昌魚BbTfl是否參與宿主免疫，我們構(gòu)建原核表達(dá)載體，表達(dá)并純化出重組蛋白BbTflN，復(fù)性后對其功能進(jìn)行檢測，檢測到復(fù)性后的BbTflN具有螯合鐵離子活性及抗菌活性?？咕钚缘臋z測發(fā)現(xiàn)它對革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌和革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌都有顯著的抑制作用，這說明BbTfl是一種免疫相關(guān)蛋白，可以抑制革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌如大腸