文昌魚Legumain基因的克隆、表達(dá)和功能研究.pdf

1、半胱氨酸蛋白酶(EC3.4.22)是一類催化活性位點(diǎn)含有親核的半胱氨酸殘基的肽鏈內(nèi)切酶。Legumain(C13)(EC3.4.22.34)，又稱天冬酰胺內(nèi)肽酶(AEP)，是半胱氨酸蛋白酶家族新成員。近年來，在植物、寄生蟲及哺乳動物中對于Legumain基因、蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究都取得了一定程度的進(jìn)展。但是，卻未見文昌魚的Legumain基因或蛋白的相關(guān)報(bào)道。文昌魚是現(xiàn)存的與脊椎動物原始祖先最接近的頭索動物，一直被認(rèn)為是研究脊椎動物起源

2、和進(jìn)化的模式動物。本文克隆了青島文昌魚的具有完整開放閱讀框的Legumain基因(BbLGMN)，并對其結(jié)構(gòu)、進(jìn)化、表達(dá)和功能進(jìn)行了研究。 首先，克隆得到一個(gè)全長1637bp的cDNA序列，其開放閱讀框?yàn)?308bp，編碼一個(gè)435個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈，理論分子量約48.9kDa。氨基末端有一個(gè)由15個(gè)氨基酸殘基組成的信號肽。內(nèi)部有一個(gè)肽酶C13超家族結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域內(nèi)有一個(gè)His153andCys195催化二聯(lián)體和一個(gè)保守的K

3、GD(Lys123-Gly124-Asp125)基序。多個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基分別位于第226、386、398、418及435位。與曼氏血吸蟲、長角血蜱、海鞘、斑馬魚、非洲爪蟾，牛，人的Legumain的同源性分別為36.6％、45.9％、46.1％、49.8％、49.4％、47.1％和48.5％。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示BbLGMN和海鞘的Legumain獨(dú)聚一支，位于脊椎動物的基部，提示文昌魚Legumain基因可能是脊椎動物L(fēng)eguma

4、in基因的原祖型。 其次，采用畢赤酵母X-33真核表達(dá)系統(tǒng)得到50kDa的rBbLGMN，進(jìn)而對蛋白的生物學(xué)特征進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)rBbLGMN及內(nèi)源性的BbLGMN都能在酸性條件下，在Asn347位點(diǎn)自切去除C末端肽段，形成分子量大小為37kDa的有活性的成熟酶，能特異性切割多肽鏈中天冬酰胺殘基羧基端的肽鍵。而在中性及堿性環(huán)境中就會失去自切及對特異性底物(Z-Ala-Ala-Asn-MCA)的酶切活性；成體文昌魚肝盲囊中內(nèi)源性B

5、bLGMN在pH5.5的緩沖環(huán)境中活性最高。rBbLGMN的活性，能被碘乙酰胺及N-乙基順丁烯二酰亞胺抑制；被蛋清半胱氨酸蛋白酶抑制劑部分抑制，卻不被苯甲基磺酰氟化物，胃酶抑素A和E-64抑制。 再者，我們研究了BbLGMN在成體文昌魚各組織中的表達(dá)情況。內(nèi)源性酶活性檢測及Westernblot分析結(jié)果都表明BbLGMN蛋白主要在肝盲囊及后腸表達(dá)，Northernblot和qRT-PCR分析也進(jìn)一步證明了這一點(diǎn)。文昌魚BbLG

6、MN呈現(xiàn)出組織特異性表達(dá)模式。文昌魚的肝盲囊被認(rèn)為是哺乳動物的肝臟和胰臟的起源。Legumain在文昌魚消化道內(nèi)呈現(xiàn)的組織特異性分布提示這種酶可能和食物大分子的降解有關(guān)。 最后，鑒于哺乳動物L(fēng)egumain參與機(jī)體免疫過程中抗原的加工與遞呈，我們對BbLGMN在免疫方面的功能進(jìn)行了初步探討。在LPS處理文昌魚后，BbLGMN的表達(dá)量增加，提示BbLGMN可能參與了文昌魚的免疫防御，但是BbLGMN卻沒有抑菌作用。 所