文昌魚Legumain基因的克隆、表達和功能研究.pdf

1、半胱氨酸蛋白酶(EC3.4.22)是一類催化活性位點含有親核的半胱氨酸殘基的肽鏈內(nèi)切酶。Legumain(C13)(EC3.4.22.34)，又稱天冬酰胺內(nèi)肽酶(AEP)，是半胱氨酸蛋白酶家族新成員。近年來，在植物、寄生蟲及哺乳動物中對于Legumain基因、蛋白的結構和功能研究都取得了一定程度的進展。但是，卻未見文昌魚的Legumain基因或蛋白的相關報道。文昌魚是現(xiàn)存的與脊椎動物原始祖先最接近的頭索動物，一直被認為是研究脊椎動物起源

2、和進化的模式動物。本文克隆了青島文昌魚的具有完整開放閱讀框的Legumain基因(BbLGMN)，并對其結構、進化、表達和功能進行了研究。 首先，克隆得到一個全長1637bp的cDNA序列，其開放閱讀框為1308bp，編碼一個435個氨基酸殘基的多肽鏈，理論分子量約48.9kDa。氨基末端有一個由15個氨基酸殘基組成的信號肽。內(nèi)部有一個肽酶C13超家族結構域。結構域內(nèi)有一個His153andCys195催化二聯(lián)體和一個保守的K

3、GD(Lys123-Gly124-Asp125)基序。多個高度保守的半胱氨酸殘基分別位于第226、386、398、418及435位。與曼氏血吸蟲、長角血蜱、海鞘、斑馬魚、非洲爪蟾，牛，人的Legumain的同源性分別為36.6％、45.9％、46.1％、49.8％、49.4％、47.1％和48.5％。系統(tǒng)進化分析顯示BbLGMN和海鞘的Legumain獨聚一支，位于脊椎動物的基部，提示文昌魚Legumain基因可能是脊椎動物Leguma

4、in基因的原祖型。 其次，采用畢赤酵母X-33真核表達系統(tǒng)得到50kDa的rBbLGMN，進而對蛋白的生物學特征進行研究。發(fā)現(xiàn)rBbLGMN及內(nèi)源性的BbLGMN都能在酸性條件下，在Asn347位點自切去除C末端肽段，形成分子量大小為37kDa的有活性的成熟酶，能特異性切割多肽鏈中天冬酰胺殘基羧基端的肽鍵。而在中性及堿性環(huán)境中就會失去自切及對特異性底物(Z-Ala-Ala-Asn-MCA)的酶切活性；成體文昌魚肝盲囊中內(nèi)源性B

5、bLGMN在pH5.5的緩沖環(huán)境中活性最高。rBbLGMN的活性，能被碘乙酰胺及N-乙基順丁烯二酰亞胺抑制；被蛋清半胱氨酸蛋白酶抑制劑部分抑制，卻不被苯甲基磺酰氟化物，胃酶抑素A和E-64抑制。 再者，我們研究了BbLGMN在成體文昌魚各組織中的表達情況。內(nèi)源性酶活性檢測及Westernblot分析結果都表明BbLGMN蛋白主要在肝盲囊及后腸表達，Northernblot和qRT-PCR分析也進一步證明了這一點。文昌魚BbLG

6、MN呈現(xiàn)出組織特異性表達模式。文昌魚的肝盲囊被認為是哺乳動物的肝臟和胰臟的起源。Legumain在文昌魚消化道內(nèi)呈現(xiàn)的組織特異性分布提示這種酶可能和食物大分子的降解有關。 最后，鑒于哺乳動物Legumain參與機體免疫過程中抗原的加工與遞呈，我們對BbLGMN在免疫方面的功能進行了初步探討。在LPS處理文昌魚后，BbLGMN的表達量增加，提示BbLGMN可能參與了文昌魚的免疫防御，但是BbLGMN卻沒有抑菌作用。 所